Para efetivamentecontrolar mosquitosPara reduzir a incidência de doenças que transmitem, são necessárias alternativas estratégicas, sustentáveis e ecologicamente corretas aos pesticidas químicos. Avaliamos farinhas de sementes de certas Brassicaceae (família Brassica) como fonte de isotiocianatos derivados de plantas, produzidos por hidrólise enzimática de glucosinolatos biologicamente inativos, para uso no controle do Aedes egípcio (L., 1762). Farinha de cinco sementes desengorduradas (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 e Thlaspi arvense – três tipos principais de inativação térmica e degradação enzimática Produtos químicos Para determinar a toxicidade (CL50) de isotiocianato de alila, isotiocianato de benzila e 4-hidroxibenzilisotiocianato para larvas de Aedes aegypti em exposição de 24 horas = 0,04 g/120 ml dH2O). Valores de CL50 para mostarda, mostarda branca e cavalinha. A farinha de semente foi de 0,05, 0,08 e 0,05, respectivamente, em comparação com o isotiocianato de alila (LC50 = 19,35 ppm) e o 4. -hidroxibenzilisotiocianato (LC50 = 55,41 ppm) foi mais tóxico para as larvas após 24 horas do tratamento do que 0,1 g/120 ml de dH2O, respectivamente. Esses resultados são consistentes com a produção de farinha de semente de alfafa. A maior eficiência dos ésteres benzílicos corresponde aos valores de CL50 calculados. O uso de farinha de semente pode fornecer um método eficaz de controle de mosquitos. A eficácia do pó de sementes de crucíferas e seus principais componentes químicos contra larvas de mosquitos e mostra como os compostos naturais no pó de sementes de crucíferas podem servir como um larvicida promissor e ecologicamente correto para o controle de mosquitos.
Doenças transmitidas por vetores causadas por mosquitos Aedes continuam sendo um grande problema de saúde pública global. A incidência de doenças transmitidas por mosquitos se espalha geograficamente1,2,3 e ressurge, levando a surtos de doenças graves4,5,6,7. A disseminação de doenças entre humanos e animais (por exemplo, chikungunya, dengue, febre do Vale do Rift, febre amarela e vírus Zika) não tem precedentes. A dengue sozinha coloca aproximadamente 3,6 bilhões de pessoas em risco de infecção nos trópicos, com uma estimativa de 390 milhões de infecções ocorrendo anualmente, resultando em 6.100 a 24.300 mortes por ano8. O reaparecimento e o surto do vírus Zika na América do Sul atraíram a atenção mundial devido aos danos cerebrais que causa em crianças nascidas de mulheres infectadas2. Kremer et al3 preveem que a distribuição geográfica dos mosquitos Aedes continuará a se expandir e que, até 2050, metade da população mundial estará em risco de infecção por arbovírus transmitidos por mosquitos.
Com exceção das vacinas recentemente desenvolvidas contra a dengue e a febre amarela, as vacinas contra a maioria das doenças transmitidas por mosquitos ainda não foram desenvolvidas9,10,11. As vacinas ainda estão disponíveis em quantidades limitadas e são usadas apenas em ensaios clínicos. O controle de mosquitos vetores usando inseticidas sintéticos tem sido uma estratégia fundamental para controlar a disseminação de doenças transmitidas por mosquitos12,13. Embora os pesticidas sintéticos sejam eficazes na eliminação de mosquitos, o uso contínuo de pesticidas sintéticos afeta negativamente organismos não alvos e polui o meio ambiente14,15,16. Ainda mais alarmante é a tendência de aumento da resistência dos mosquitos a inseticidas químicos17,18,19. Esses problemas associados aos pesticidas aceleraram a busca por alternativas eficazes e ecologicamente corretas para controlar vetores de doenças.
Várias plantas foram desenvolvidas como fontes de fitopesticidas para o controle de pragas20,21. Substâncias vegetais são geralmente ecologicamente corretas porque são biodegradáveis e têm toxicidade baixa ou insignificante para organismos não alvos, como mamíferos, peixes e anfíbios20,22. Preparações herbais são conhecidas por produzir uma variedade de compostos bioativos com diferentes mecanismos de ação para controlar eficazmente diferentes estágios de vida dos mosquitos23,24,25,26. Compostos derivados de plantas, como óleos essenciais e outros ingredientes ativos de plantas, ganharam atenção e abriram caminho para ferramentas inovadoras para controlar mosquitos vetores. Óleos essenciais, monoterpenos e sesquiterpenos atuam como repelentes, dissuasores de alimentação e ovicidas27,28,29,30,31,32,33. Muitos óleos vegetais causam a morte de larvas, pupas e adultos de mosquitos34,35,36, afetando os sistemas nervoso, respiratório, endócrino e outros sistemas importantes dos insetos37.
Estudos recentes têm fornecido insights sobre o uso potencial de plantas de mostarda e suas sementes como fonte de compostos bioativos. A farinha de semente de mostarda foi testada como biofumigante38,39,40,41 e usada como corretivo de solo para supressão de ervas daninhas42,43,44 e controle de patógenos vegetais transmitidos pelo solo45,46,47,48,49,50, nutrição de plantas, nematoides41,51, 52, 53, 54 e pragas55, 56, 57, 58, 59, 60. A atividade fungicida desses pós de sementes é atribuída a compostos protetores de plantas chamados isotiocianatos38,42,60. Nas plantas, esses compostos protetores são armazenados em células vegetais na forma de glucosinolatos não bioativos. No entanto, quando as plantas são danificadas pela alimentação de insetos ou infecção por patógenos, os glucosinolatos são hidrolisados pela mirosinase em isotiocianatos bioativos55,61. Os isotiocianatos são compostos voláteis conhecidos por possuírem atividade antimicrobiana e inseticida de amplo espectro, e sua estrutura, atividade biológica e conteúdo variam amplamente entre as espécies de Brassicaceae42,59,62,63.
Embora os isotiocianatos derivados da farinha de semente de mostarda sejam conhecidos por terem atividade inseticida, faltam dados sobre a atividade biológica contra vetores artrópodes de importância médica. Nosso estudo examinou a atividade larvicida de quatro pós de sementes desengorduradas contra mosquitos Aedes. Larvas de Aedes aegypti. O objetivo do estudo foi avaliar seu uso potencial como biopesticidas ecologicamente corretos para o controle de mosquitos. Três principais componentes químicos da farinha de semente, isotiocianato de alila (AITC), isotiocianato de benzila (BITC) e 4-hidroxibenzilisotiocianato (4-HBITC) também foram testados para testar a atividade biológica desses componentes químicos em larvas de mosquito. Este é o primeiro relatório a avaliar a eficácia de quatro pós de sementes de repolho e seus principais componentes químicos contra larvas de mosquito.
Colônias de laboratório de Aedes aegypti (cepa Rockefeller) foram mantidas a 26 °C, 70% de umidade relativa (UR) e 10:14 h (fotoperíodo L:D). Fêmeas acasaladas foram alojadas em gaiolas plásticas (altura 11 cm e diâmetro 9,5 cm) e alimentadas por mamadeira com sangue bovino citratado (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, EUA). A alimentação com sangue foi realizada como de costume, usando um alimentador de membrana multividro (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, EUA) conectado a um tubo de banho-maria circulante (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, EUA) com controle de temperatura de 37 °C. Estique um filme de Parafilm M sobre o fundo de cada câmara de alimentação de vidro (área 154 mm²). Cada alimentador foi então colocado na grade superior que cobre a gaiola contendo a fêmea acasalante. Aproximadamente 350–400 μl de sangue bovino foram adicionados a um funil de alimentação de vidro usando uma pipeta Pasteur (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e os vermes adultos foram deixados em repouso por pelo menos uma hora. Fêmeas prenhes receberam então uma solução de sacarose a 10% e depositaram ovos em papel de filtro úmido, forrados em forminhas individuais ultratransparentes para suflê (tamanho 35 ml, Dart Container Corp., Mason, MI, EUA). A gaiola foi preenchida com água. Coloque o papel de filtro contendo os ovos em um saco selado (SC Johnsons, Racine, WI) e armazene a 26 °C. Os ovos eclodiram e aproximadamente 200–250 larvas foram criadas em bandejas plásticas contendo uma mistura de ração para coelhos (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, EUA) e pó de fígado (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, EUA). e filé de peixe (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Alemanha) na proporção de 2:1:1. Larvas tardias de terceiro ínstar foram usadas em nossos bioensaios.
O material de sementes vegetais utilizado neste estudo foi obtido das seguintes fontes comerciais e governamentais: Brassica juncea (mostarda marrom-Pacific Gold) e Brassica juncea (mostarda branca-Ida Gold) da Pacific Northwest Farmers' Cooperative, estado de Washington, EUA; (Garden Cress) da Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, EUA; e Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) do USDA-ARS, Peoria, IL, EUA; Nenhuma das sementes utilizadas no estudo foi tratada com pesticidas. Todo o material de sementes foi processado e utilizado neste estudo de acordo com as regulamentações locais e nacionais e em conformidade com todas as regulamentações locais, estaduais e nacionais relevantes. Este estudo não examinou variedades de plantas transgênicas.
Sementes de Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), Mostarda-branca (IG) e Thlaspi arvense (DFP) foram moídas até um pó fino usando um moinho ultracentrífugo Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Alemanha) equipado com uma malha de 0,75 mm e rotor de aço inoxidável, 12 dentes, 10.000 rpm (Tabela 1). O pó da semente moída foi transferido para um dedal de papel e desengordurado com hexano em um aparelho Soxhlet por 24 h. Uma subamostra de mostarda de campo desengordurada foi tratada termicamente a 100 °C por 1 h para desnaturar a mirosinase e prevenir a hidrólise de glucosinolatos para formar isotiocianatos biologicamente ativos. Pó de semente de cavalinha tratado termicamente (DFP-HT) foi usado como controle negativo pela desnaturação da mirosinase.
O teor de glucosinolato da farinha de sementes desengorduradas foi determinado em triplicata usando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) de acordo com um protocolo publicado anteriormente 64 . Resumidamente, 3 mL de metanol foram adicionados a uma amostra de 250 mg de pó de sementes desengorduradas. Cada amostra foi sonicada em banho-maria por 30 minutos e deixada no escuro a 23 °C por 16 horas. Uma alíquota de 1 mL da camada orgânica foi então filtrada através de um filtro de 0,45 μm em um amostrador automático. Executando em um sistema Shimadzu HPLC (duas bombas LC 20AD; amostrador automático SIL 20A; desgaseificador DGU 20As; detector UV-VIS SPD-20A para monitoramento a 237 nm; e módulo de barramento de comunicação CBM-20A), o teor de glucosinolato da farinha de sementes foi determinado em triplicata . utilizando o software Shimadzu LC Solution versão 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, EUA). A coluna utilizada foi uma coluna de fase reversa C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, EUA). As condições iniciais da fase móvel foram fixadas em 12% de metanol/88% de hidróxido de tetrabutilamônio 0,01 M em água (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) com uma vazão de 1 mL/min. Após a injeção de 15 μl de amostra, as condições iniciais foram mantidas por 20 minutos e, em seguida, a proporção de solventes foi ajustada para 100% de metanol, com um tempo total de análise da amostra de 65 minutos. Uma curva padrão (baseada em nM/mAb) foi gerada por diluições seriais de padrões de sinapina, glucosinolato e mirosina recém-preparados (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) para estimar o teor de enxofre da farinha de sementes desengorduradas. As concentrações de glucosinolato nas amostras foram testadas em um HPLC Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) usando o OpenLAB CDS ChemStation versão (C.01.07 SR2 [255]) equipado com a mesma coluna e usando um método descrito anteriormente. As concentrações de glucosinolato foram determinadas; devem ser comparáveis entre os sistemas de HPLC.
O isotiocianato de alila (94%, estável) e o isotiocianato de benzila (98%) foram adquiridos da Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). O 4-hidroxibenzilisotiocianato foi adquirido da ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). Quando hidrolisados enzimaticamente pela mirosinase, glucosinolatos, glucosinolatos e glucosinolatos formam isotiocianato de alila, isotiocianato de benzila e 4-hidroxibenzilisotiocianato, respectivamente.
Bioensaios de laboratório foram realizados de acordo com o método de Muturi et al. 32 com modificações. Cinco alimentos de sementes com baixo teor de gordura foram usados no estudo: DFP, DFP-HT, IG, PG e Ls. Vinte larvas foram colocadas em um béquer descartável de três vias de 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, EUA) contendo 120 mL de água deionizada (dH2O). Sete concentrações de farinha de sementes foram testadas para toxicidade larval de mosquito: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 e 0,12 g de farinha de sementes/120 ml de dH2O para farinha de sementes DFP, DFP-HT, IG e PG. Bioensaios preliminares indicam que a farinha de sementes desengordurada de Ls é mais tóxica do que quatro outras farinhas de sementes testadas. Portanto, ajustamos as sete concentrações de tratamento de farinha de semente de Ls para as seguintes concentrações: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 e 0,075 g/120 mL dH2O.
Um grupo controle não tratado (dH20, sem suplemento de farinha de sementes) foi incluído para avaliar a mortalidade normal de insetos sob condições de ensaio. Bioensaios toxicológicos para cada farinha de sementes incluíram três béqueres de três inclinações replicados (20 larvas de terceiro ínstar tardio por béquer), para um total de 108 frascos. Os recipientes tratados foram armazenados em temperatura ambiente (20-21 °C) e a mortalidade larval foi registrada durante 24 e 72 horas de exposição contínua às concentrações de tratamento. Se o corpo e os apêndices do mosquito não se moverem quando perfurados ou tocados com uma espátula fina de aço inoxidável, as larvas do mosquito são consideradas mortas. As larvas mortas geralmente permanecem imóveis em uma posição dorsal ou ventral no fundo do recipiente ou na superfície da água. O experimento foi repetido três vezes em dias diferentes usando diferentes grupos de larvas, para um total de 180 larvas expostas a cada concentração de tratamento.
A toxicidade de AITC, BITC e 4-HBITC para larvas de mosquito foi avaliada usando o mesmo procedimento de bioensaio, mas com tratamentos diferentes. Prepare soluções estoque de 100.000 ppm para cada produto químico adicionando 100 µL do produto químico a 900 µL de etanol absoluto em um tubo de centrífuga de 2 mL e agitando por 30 segundos para misturar completamente. As concentrações de tratamento foram determinadas com base em nossos bioensaios preliminares, que descobriram que BITC é muito mais tóxico do que AITC e 4-HBITC. Para determinar a toxicidade, 5 concentrações de BITC (1, 3, 6, 9 e 12 ppm), 7 concentrações de AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35 ppm) e 6 concentrações de 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 e 35 ppm). 30, 45, 60, 75 e 90 ppm). O tratamento controle foi injetado com 108 μL de etanol absoluto, equivalente ao volume máximo do tratamento químico. Os bioensaios foram repetidos conforme descrito acima, expondo um total de 180 larvas por concentração de tratamento. A mortalidade larval foi registrada para cada concentração de AITC, BITC e 4-HBITC após 24 h de exposição contínua.
A análise de probit de 65 dados de mortalidade relacionados à dose foi realizada usando o software Polo (Polo Plus, LeOra Software, versão 1.0) para calcular a concentração letal de 50% (CL50), a concentração letal de 90% (CL90), a inclinação, o coeficiente de dose letal e a concentração letal de 95%. com base em intervalos de confiança para razões de dose letal para curvas de concentração transformadas em logaritmo e de mortalidade por dose. Os dados de mortalidade são baseados em dados replicados combinados de 180 larvas expostas a cada concentração de tratamento. As análises probabilísticas foram realizadas separadamente para cada farinha de semente e cada componente químico. Com base no intervalo de confiança de 95% da razão de dose letal, a toxicidade da farinha de semente e dos constituintes químicos para larvas de mosquito foi considerada significativamente diferente, portanto, um intervalo de confiança contendo um valor de 1 não foi significativamente diferente, P = 0,0566.
Os resultados de HPLC para a determinação dos principais glucosinolatos nas farinhas de sementes desengorduradas DFP, IG, PG e Ls estão listados na Tabela 1. Os principais glucosinolatos nas farinhas de sementes testadas variaram, com exceção de DFP e PG, que continham glucosinolatos de mirosinase. O teor de mirosinina em PG foi maior do que em DFP, 33,3 ± 1,5 e 26,5 ± 0,9 mg/g, respectivamente. O pó de semente de Ls continha 36,6 ± 1,2 mg/g de glucoglicona, enquanto o pó de semente de IG continha 38,0 ± 0,5 mg/g de sinapina.
Larvas de mosquitos Ae. Aedes aegypti foram mortas quando tratadas com farinha de semente desengordurada, embora a eficácia do tratamento tenha variado dependendo da espécie de planta. Apenas o DFP-NT não se mostrou tóxico para larvas de mosquito após 24 e 72 h de exposição (Tabela 2). A toxicidade do pó de semente ativo aumentou com o aumento da concentração (Fig. 1A, B). A toxicidade da farinha de semente para larvas de mosquito variou significativamente com base no IC de 95% da razão de dose letal dos valores de CL50 nas avaliações de 24 e 72 horas (Tabela 3). Após 24 horas, o efeito tóxico da farinha de semente de Ls foi maior do que outros tratamentos de farinha de semente, com a maior atividade e toxicidade máxima para larvas (CL50 = 0,04 g/120 ml dH2O). As larvas foram menos sensíveis ao DFP em 24 horas em comparação aos tratamentos com pó de semente IG, Ls e PG, com valores de CL50 de 0,115, 0,04 e 0,08 g/120 ml dH2O respectivamente, que foram estatisticamente maiores que o valor de CL50. 0,211 g/120 ml dH2O (Tabela 3). Os valores de CL90 de DFP, IG, PG e Ls foram 0,376, 0,275, 0,137 e 0,074 g/120 ml dH2O, respectivamente (Tabela 2). A maior concentração de DPP foi de 0,12 g/120 ml dH2O. Após 24 horas de avaliação, a mortalidade larval média foi de apenas 12%, enquanto a mortalidade média das larvas IG e PG atingiu 51% e 82%, respectivamente. Após 24 horas de avaliação, a mortalidade larval média para a maior concentração de tratamento com farinha de semente de Ls (0,075 g/120 ml dH2O) foi de 99% (Fig. 1A).
As curvas de mortalidade foram estimadas a partir da dose-resposta (Probit) de larvas de Ae. Egyptian (larvas de 3º ínstar) à concentração de farinha de sementes 24 horas (A) e 72 horas (B) após o tratamento. A linha pontilhada representa a CL50 do tratamento com farinha de sementes. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense inativado pelo calor, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Na avaliação de 72 horas, os valores de CL50 da farinha de sementes DFP, IG e PG foram 0,111, 0,085 e 0,051 g/120 ml dH2O, respectivamente. Quase todas as larvas expostas à farinha de sementes Ls morreram após 72 h de exposição, portanto os dados de mortalidade foram inconsistentes com a análise Probit. Em comparação com outras farinhas de sementes, as larvas foram menos sensíveis ao tratamento com farinha de sementes DFP e apresentaram valores de CL50 estatisticamente maiores (Tabelas 2 e 3). Após 72 horas, os valores de CL50 para os tratamentos com farinha de sementes DFP, IG e PG foram estimados em 0,111, 0,085 e 0,05 g/120 ml dH2O, respectivamente. Após 72 horas de avaliação, os valores de CL90 dos pós de sementes de DFP, IG e PG foram de 0,215, 0,254 e 0,138 g/120 ml dH2O, respectivamente. Após 72 horas de avaliação, a mortalidade larval média para os tratamentos com farinha de sementes de DFP, IG e PG na concentração máxima de 0,12 g/120 ml dH2O foi de 58%, 66% e 96%, respectivamente (Fig. 1B). Após 72 horas de avaliação, constatou-se que a farinha de sementes de PG foi mais tóxica do que as farinhas de sementes de IG e DFP.
Isotiocianatos sintéticos, isotiocianato de alila (AITC), isotiocianato de benzila (BITC) e 4-hidroxibenzilisotiocianato (4-HBITC) podem matar larvas de mosquitos com eficácia. Vinte e quatro horas após o tratamento, o BITC foi mais tóxico para as larvas, com um valor de CL50 de 5,29 ppm, em comparação com 19,35 ppm para o AITC e 55,41 ppm para o 4-HBITC (Tabela 4). Comparado ao AITC e ao BITC, o 4-HBITC apresenta menor toxicidade e um valor de CL50 mais alto. Há diferenças significativas na toxicidade larval para mosquitos dos dois principais isotiocianatos (Ls e PG) na farinha de semente mais potente. A toxicidade baseada na razão de dose letal dos valores de CL50 entre AITC, BITC e 4-HBITC apresentou uma diferença estatística tal que o IC de 95% da razão de dose letal da CL50 não incluiu o valor 1 (P = 0,05, Tabela 4). Estimou-se que as concentrações mais altas de BITC e AITC mataram 100% das larvas testadas (Figura 2).
As curvas de mortalidade foram estimadas a partir da resposta à dose (Probit) de Ae. 24 horas após o tratamento, larvas egípcias (larvas de 3º ínstar) atingiram concentrações de isotiocianato sintético. A linha pontilhada representa a CL50 para o tratamento com isotiocianato. Isotiocianato de benzila BITC, isotiocianato de alila AITC e 4-HBITC.
O uso de biopesticidas vegetais como agentes de controle de vetores de mosquitos vem sendo estudado há muito tempo. Muitas plantas produzem substâncias químicas naturais com atividade inseticida37. Seus compostos bioativos oferecem uma alternativa atraente aos inseticidas sintéticos, com grande potencial no controle de pragas, incluindo mosquitos.
As plantas de mostarda são cultivadas como uma cultura por suas sementes, usadas como tempero e fonte de óleo. Quando o óleo de mostarda é extraído das sementes ou quando a mostarda é extraída para uso como biocombustível,69 o subproduto é farinha de semente desengordurada. Essa farinha de semente retém muitos de seus componentes bioquímicos naturais e enzimas hidrolíticas. A toxicidade dessa farinha de semente é atribuída à produção de isotiocianatos55,60,61. Os isotiocianatos são formados pela hidrólise de glucosinolatos pela enzima mirosinase durante a hidratação da farinha de semente38,55,70 e são conhecidos por terem efeitos fungicidas, bactericidas, nematicidas e inseticidas, bem como outras propriedades, incluindo efeitos sensoriais químicos e propriedades quimioterápicas61,62,70. Vários estudos mostraram que as plantas de mostarda e a farinha de semente atuam efetivamente como fumigantes contra pragas do solo e de alimentos armazenados57,59,71,72. Neste estudo, avaliamos a toxicidade da farinha de quatro sementes e seus três produtos bioativos AITC, BITC e 4-HBITC para larvas do mosquito Aedes. Aedes aegypti. A adição de farinha de sementes diretamente à água contendo larvas de mosquito deve ativar processos enzimáticos que produzem isotiocianatos tóxicos para larvas de mosquito. Essa biotransformação foi demonstrada em parte pela atividade larvicida observada na farinha de sementes e pela perda de atividade inseticida quando a farinha de sementes de mostarda-anã foi tratada termicamente antes do uso. Espera-se que o tratamento térmico destrua as enzimas hidrolíticas que ativam os glucosinolatos, prevenindo assim a formação de isotiocianatos bioativos. Este é o primeiro estudo a confirmar as propriedades inseticidas do pó de sementes de repolho contra mosquitos em ambiente aquático.
Entre os pós de sementes testados, o pó de semente de agrião (Ls) foi o mais tóxico, causando alta mortalidade de Aedes albopictus. Larvas de Aedes aegypti foram processadas continuamente por 24 horas. Os três pós de sementes restantes (PG, IG e DFP) tiveram atividade mais lenta e ainda causaram mortalidade significativa após 72 horas de tratamento contínuo. Apenas a farinha de semente de Ls continha quantidades significativas de glucosinolatos, enquanto PG e DFP continham mirosinase e IG continha glucosinolato como o principal glucosinolato (Tabela 1). A glucotropaeolina é hidrolisada para BITC e a sinalbina é hidrolisada para 4-HBITC61,62. Nossos resultados de bioensaio indicam que tanto a farinha de semente de Ls quanto o BITC sintético são altamente tóxicos para larvas de mosquito. O principal componente da farinha de semente de PG e DFP é o glucosinolato de mirosinase, que é hidrolisado para AITC. O AITC é eficaz na eliminação de larvas de mosquitos, com um valor de CL50 de 19,35 ppm. Comparado ao AITC e ao BITC, o isotiocianato de 4-HBITC é o menos tóxico para as larvas. Embora o AITC seja menos tóxico que o BITC, seus valores de CL50 são inferiores aos de muitos óleos essenciais testados em larvas de mosquitos32,73,74,75.
Nosso pó de sementes de crucíferas para uso contra larvas de mosquitos contém um glucosinolato principal, representando mais de 98-99% do total de glucosinolatos, conforme determinado por HPLC. Traços de outros glucosinolatos foram detectados, mas seus níveis foram inferiores a 0,3% do total de glucosinolatos. O pó de sementes de agrião (L. sativum) contém glucosinolatos secundários (sinigrina), mas sua proporção é de 1% do total de glucosinolatos, e seu conteúdo ainda é insignificante (cerca de 0,4 mg/g de pó de semente). Embora PG e DFP contenham o mesmo glucosinolato principal (mirosina), a atividade larvicida de suas farinhas de sementes difere significativamente devido aos seus valores de CL50. Varia em toxicidade para oídio. O surgimento de larvas de Aedes aegypti pode ser devido a diferenças na atividade da mirosinase ou na estabilidade entre as duas farinhas de sementes. A atividade da mirosinase desempenha um papel importante na biodisponibilidade de produtos de hidrólise, como isotiocianatos, em plantas Brassicaceae76. Relatórios anteriores de Pocock et al.77 e Wilkinson et al.78 demonstraram que alterações na atividade e estabilidade da mirosinase também podem estar associadas a fatores genéticos e ambientais.
O conteúdo esperado de isotiocianato bioativo foi calculado com base nos valores de CL50 de cada farinha de semente em 24 e 72 horas (Tabela 5) para comparação com aplicações químicas correspondentes. Após 24 horas, os isotiocianatos na farinha de semente foram mais tóxicos do que os compostos puros. Os valores de CL50 calculados com base em partes por milhão (ppm) de tratamentos de sementes com isotiocianato foram menores do que os valores de CL50 para aplicações de BITC, AITC e 4-HBITC. Observamos larvas consumindo pellets de farinha de semente (Figura 3A). Consequentemente, as larvas podem receber exposição mais concentrada a isotiocianatos tóxicos pela ingestão de pellets de farinha de semente. Isso foi mais evidente nos tratamentos de farinha de semente IG e PG em exposição de 24 h, onde as concentrações de CL50 foram 75% e 72% menores do que os tratamentos AITC e 4-HBITC puros, respectivamente. Os tratamentos com Ls e DFP foram mais tóxicos do que o isotiocianato puro, com valores de CL50 24% e 41% menores, respectivamente. As larvas no tratamento controle puparam com sucesso (Fig. 3B), enquanto a maioria das larvas no tratamento com farinha de sementes não pupou e o desenvolvimento larval foi significativamente atrasado (Fig. 3B,D). Em Spodopteralitura, os isotiocianatos estão associados ao retardo do crescimento e ao atraso no desenvolvimento79.
Larvas de mosquitos Aedes aegypti foram expostas continuamente ao pó de sementes de brássica por 24 a 72 horas. (A) Larvas mortas com partículas de farinha de sementes nas peças bucais (circuladas); (B) O tratamento controle (dH20 sem adição de farinha de sementes) mostra que as larvas crescem normalmente e começam a empupar após 72 horas. (C, D) Larvas tratadas com farinha de sementes; a farinha de sementes apresentou diferenças no desenvolvimento e não empupou.
Não estudamos o mecanismo dos efeitos tóxicos dos isotiocianatos em larvas de mosquitos. No entanto, estudos anteriores em formigas-de-fogo-vermelhas (Solenopsis invicta) demonstraram que a inibição da glutationa S-transferase (GST) e da esterase (EST) é o principal mecanismo de bioatividade do isotiocianato, e o AITC, mesmo em baixa atividade, também pode inibir a atividade da GST. formigas-de-fogo-vermelhas importadas em baixas concentrações. A dose é de 0,5 µg/ml80. Em contraste, o AITC inibe a acetilcolinesterase em gorgulhos-do-milho adultos (Sitophilus zeamais)81. Estudos semelhantes devem ser realizados para elucidar o mecanismo da atividade do isotiocianato em larvas de mosquitos.
Utilizamos o tratamento DFP inativado pelo calor para apoiar a proposta de que a hidrólise de glucosinolatos vegetais para formar isotiocianatos reativos serve como um mecanismo para o controle de larvas de mosquitos pela farinha de semente de mostarda. A farinha de semente DFP-HT não foi tóxica nas taxas de aplicação testadas. Lafarga et al. 82 relataram que os glucosinolatos são sensíveis à degradação em altas temperaturas. O tratamento térmico também deve desnaturar a enzima mirosinase na farinha de semente e impedir a hidrólise de glucosinolatos para formar isotiocianatos reativos. Isso também foi confirmado por Okunade et al. 75 mostraram que a mirosinase é sensível à temperatura, mostrando que a atividade da mirosinase foi completamente inativada quando sementes de mostarda, mostarda preta e sanguinária foram expostas a temperaturas acima de 80 °C. Esses mecanismos podem resultar na perda da atividade inseticida da farinha de semente DFP tratada termicamente.
Assim, a farinha de semente de mostarda e seus três principais isotiocianatos são tóxicos para larvas de mosquitos. Dadas essas diferenças entre a farinha de semente e os tratamentos químicos, o uso da farinha de semente pode ser um método eficaz de controle de mosquitos. Há uma necessidade de identificar formulações adequadas e sistemas de entrega eficazes para melhorar a eficácia e a estabilidade do uso de pós de sementes. Nossos resultados indicam o uso potencial da farinha de semente de mostarda como uma alternativa aos pesticidas sintéticos. Essa tecnologia pode se tornar uma ferramenta inovadora para o controle de mosquitos vetores. Como as larvas de mosquito prosperam em ambientes aquáticos e os glucosinolatos da farinha de semente são convertidos enzimaticamente em isotiocianatos ativos após a hidratação, o uso da farinha de semente de mostarda em água infestada por mosquitos oferece um potencial de controle significativo. Embora a atividade larvicida dos isotiocianatos varie (BITC > AITC > 4-HBITC), mais pesquisas são necessárias para determinar se a combinação de farinha de semente com múltiplos glucosinolatos aumenta sinergicamente a toxicidade. Este é o primeiro estudo a demonstrar os efeitos inseticidas da farinha de sementes de crucíferas desengorduradas e de três isotiocianatos bioativos sobre mosquitos. Os resultados deste estudo inovam ao mostrar que a farinha de sementes de repolho desengordurada, um subproduto da extração do óleo das sementes, pode servir como um agente larvicida promissor para o controle de mosquitos. Essas informações podem contribuir para a descoberta de agentes de biocontrole de plantas e seu desenvolvimento como biopesticidas baratos, práticos e ecologicamente corretos.
Os conjuntos de dados gerados para este estudo e as análises resultantes estão disponíveis junto ao autor correspondente mediante solicitação razoável. Ao final do estudo, todos os materiais utilizados (insetos e farinha de sementes) foram destruídos.
Horário da publicação: 29 de julho de 2024