Para ser eficazcontrolar mosquitosPara reduzir a incidência das doenças que transmitem, são necessárias alternativas estratégicas, sustentáveis e ambientalmente amigáveis aos pesticidas químicos. Avaliamos farinhas de sementes de certas Brassicaceae (família Brassica) como fonte de isotiocianatos de origem vegetal, produzidos por hidrólise enzimática de glucosinolatos biologicamente inativos, para uso no controle do mosquito Aedes egípcio (L., 1762). Farinha de sementes desengorduradas (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 e Thlaspi arvense – três principais tipos de inativação térmica e degradação enzimática). Produtos químicos. Determinar a toxicidade (CL50) do isotiocianato de alila, isotiocianato de benzila e 4-hidroxibenzilisotiocianato para larvas de Aedes aegypti em exposição de 24 horas = 0,04 g/120 ml de água destilada. Valores de CL50 para mostarda, mostarda branca e cavalinha. A farinha de sementes apresentou valores de 0,05, 0,08 e 0,05, respectivamente, em comparação com o isotiocianato de alila (CL50 = 19,35 ppm) e o 4-hidroxibenzilisotiocianato (CL50 = 55,41 ppm), que se mostrou mais tóxico para as larvas 24 horas após o tratamento do que 0,1 g/120 ml de água destilada. Esses resultados são consistentes com a produção de farinha de sementes de alfafa. A maior eficiência dos ésteres benzílicos corresponde aos valores de CL50 calculados. O uso de farinha de sementes pode fornecer um método eficaz para o controle de mosquitos. A eficácia do pó de sementes de crucíferas e seus principais componentes químicos contra larvas de mosquito demonstra como os compostos naturais presentes no pó de sementes de crucíferas podem servir como um larvicida promissor e ecologicamente correto para o controle de mosquitos.
Doenças transmitidas por vetores, causadas por mosquitos Aedes, continuam sendo um grande problema de saúde pública global. A incidência dessas doenças se espalha geograficamente1,2,3 e ressurge, levando a surtos de doenças graves4,5,6,7. A disseminação de doenças entre humanos e animais (por exemplo, chikungunya, dengue, febre do Vale do Rift, febre amarela e vírus Zika) é sem precedentes. Somente a dengue coloca aproximadamente 3,6 bilhões de pessoas em risco de infecção nos trópicos, com uma estimativa de 390 milhões de infecções ocorrendo anualmente, resultando em 6.100 a 24.300 mortes por ano8. O reaparecimento e o surto do vírus Zika na América do Sul atraíram a atenção mundial devido aos danos cerebrais que causa em crianças nascidas de mulheres infectadas2. Kremer et al.3 preveem que a distribuição geográfica dos mosquitos Aedes continuará a se expandir e que, até 2050, metade da população mundial estará em risco de infecção por arbovírus transmitidos por mosquitos.
Com exceção das vacinas recentemente desenvolvidas contra dengue e febre amarela, vacinas contra a maioria das doenças transmitidas por mosquitos ainda não foram desenvolvidas9,10,11. As vacinas ainda estão disponíveis em quantidades limitadas e são utilizadas apenas em ensaios clínicos. O controle de mosquitos vetores por meio de inseticidas sintéticos tem sido uma estratégia fundamental para controlar a disseminação de doenças transmitidas por mosquitos12,13. Embora os pesticidas sintéticos sejam eficazes para matar mosquitos, o uso contínuo desses produtos afeta negativamente organismos não-alvo e polui o meio ambiente14,15,16. Ainda mais alarmante é a tendência crescente de resistência dos mosquitos aos inseticidas químicos17,18,19. Esses problemas associados aos pesticidas aceleraram a busca por alternativas eficazes e ambientalmente amigáveis para o controle de vetores de doenças.
Diversas plantas têm sido desenvolvidas como fontes de fitopesticidas para o controle de pragas20,21. As substâncias vegetais são geralmente ecologicamente corretas, pois são biodegradáveis e apresentam baixa ou nenhuma toxicidade para organismos não-alvo, como mamíferos, peixes e anfíbios20,22. Preparações à base de ervas são conhecidas por produzirem uma variedade de compostos bioativos com diferentes mecanismos de ação para controlar eficazmente diferentes estágios de vida dos mosquitos23,24,25,26. Compostos derivados de plantas, como óleos essenciais e outros ingredientes ativos vegetais, têm atraído atenção e aberto caminho para ferramentas inovadoras no controle de vetores de mosquitos. Óleos essenciais, monoterpenos e sesquiterpenos atuam como repelentes, dissuasores alimentares e ovicidas27,28,29,30,31,32,33. Muitos óleos vegetais causam a morte de larvas, pupas e adultos de mosquitos34,35,36, afetando os sistemas nervoso, respiratório, endócrino e outros sistemas importantes dos insetos37.
Estudos recentes forneceram informações sobre o potencial de uso de plantas de mostarda e suas sementes como fonte de compostos bioativos. A farinha de semente de mostarda foi testada como biofumigante38,39,40,41 e usada como corretivo de solo para supressão de ervas daninhas42,43,44 e controle de patógenos de plantas transmitidos pelo solo45,46,47,48,49,50, nutrição vegetal, nematoides41,51,52,53,54 e pragas55,56,57,58,59,60. A atividade fungicida desses pós de sementes é atribuída a compostos protetores de plantas chamados isotiocianatos38,42,60. Nas plantas, esses compostos protetores são armazenados nas células vegetais na forma de glucosinolatos não bioativos. No entanto, quando as plantas são danificadas pela alimentação de insetos ou infecção por patógenos, os glucosinolatos são hidrolisados pela mirosinase em isotiocianatos bioativos55,61. Os isotiocianatos são compostos voláteis conhecidos por terem atividade antimicrobiana e inseticida de amplo espectro, e sua estrutura, atividade biológica e conteúdo variam amplamente entre as espécies de Brassicaceae42,59,62,63.
Embora os isotiocianatos derivados da farinha de sementes de mostarda sejam conhecidos por sua atividade inseticida, faltam dados sobre sua atividade biológica contra vetores artrópodes de importância médica. Nosso estudo examinou a atividade larvicida de quatro pós de sementes desengorduradas contra larvas de mosquitos Aedes aegypti. O objetivo do estudo foi avaliar seu potencial uso como biopesticidas ecologicamente corretos para o controle de mosquitos. Três componentes químicos principais da farinha de sementes, isotiocianato de alila (AITC), isotiocianato de benzila (BITC) e 4-hidroxibenzilisotiocianato (4-HBITC), também foram testados para verificar a atividade biológica desses componentes químicos sobre larvas de mosquito. Este é o primeiro relato a avaliar a eficácia de quatro pós de sementes de repolho e seus principais componentes químicos contra larvas de mosquito.
Colônias de laboratório de Aedes aegypti (cepa Rockefeller) foram mantidas a 26 °C, 70% de umidade relativa (UR) e fotoperíodo de 10:14 h (L:E). Fêmeas acasaladas foram alojadas em gaiolas de plástico (11 cm de altura e 9,5 cm de diâmetro) e alimentadas por meio de um sistema de mamadeira com sangue bovino citratado (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, EUA). A alimentação sanguínea foi realizada como de costume, utilizando um alimentador de vidro com membrana (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, EUA) conectado a um tubo de banho-maria com circulação de água (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, EUA) com controle de temperatura a 37 °C. Uma película de Parafilm M foi aplicada no fundo de cada câmara de alimentação de vidro (área de 154 mm²). Cada alimentador foi então colocado sobre a grade superior que cobria a gaiola contendo a fêmea em acasalamento. Aproximadamente 350–400 μl de sangue bovino foram adicionados a um funil de vidro para alimentação, utilizando uma pipeta Pasteur (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA), e os vermes adultos foram deixados escorrer por pelo menos uma hora. Em seguida, as fêmeas prenhes receberam uma solução de sacarose a 10% e foram deixadas depositar os ovos em papel de filtro umedecido, forrado com copos individuais ultratransparentes (37 ml, Dart Container Corp., Mason, MI, EUA). Os ovos foram colocados em um saco plástico selado (SC Johnsons, Racine, WI) e armazenados a 26 °C. Os ovos foram eclodidos e aproximadamente 200–250 larvas foram criadas em bandejas plásticas contendo uma mistura de ração para coelhos (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, EUA) e pó de fígado (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, EUA). e filé de peixe (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Alemanha) na proporção de 2:1:1. Larvas no final do terceiro instar foram utilizadas em nossos bioensaios.
O material de sementes vegetais utilizado neste estudo foi obtido das seguintes fontes comerciais e governamentais: Brassica juncea (mostarda marrom - Pacific Gold) e Brassica juncea (mostarda branca - Ida Gold) da Pacific Northwest Farmers' Cooperative, Washington State, EUA; (agrião-de-jardim) da Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, EUA; e Thlaspi arvense (agrião-de-campo - Elisabeth) do USDA-ARS, Peoria, IL, EUA. Nenhuma das sementes utilizadas no estudo foi tratada com pesticidas. Todo o material de sementes foi processado e utilizado neste estudo de acordo com as normas locais e nacionais e em conformidade com todas as regulamentações locais, estaduais e nacionais relevantes. Este estudo não examinou variedades de plantas transgênicas.
Sementes de Brassica juncea (PG), alfafa (Ls), mostarda branca (IG) e Thlaspi arvense (DFP) foram moídas até se obter um pó fino utilizando um moinho ultracentrífugo Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Alemanha) equipado com uma peneira de 0,75 mm e rotor de aço inoxidável com 12 dentes e rotação de 10.000 rpm (Tabela 1). O pó de sementes moídas foi transferido para um cartucho de papel e desengordurado com hexano em um extrator Soxhlet por 24 horas. Uma subamostra da mostarda branca desengordurada foi tratada termicamente a 100 °C por 1 hora para desnaturar a mirosinase e impedir a hidrólise dos glucosinolatos, evitando a formação de isotiocianatos biologicamente ativos. O pó de sementes de cavalinha tratado termicamente (DFP-HT) foi utilizado como controle negativo para a desnaturação da mirosinase.
O teor de glucosinolatos na farinha de sementes desengorduradas foi determinado em triplicata por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), de acordo com um protocolo previamente publicado64. Resumidamente, 3 mL de metanol foram adicionados a uma amostra de 250 mg de farinha de sementes desengorduradas. Cada amostra foi sonicada em banho-maria por 30 minutos e mantida no escuro a 23 °C por 16 horas. Uma alíquota de 1 mL da fase orgânica foi então filtrada através de um filtro de 0,45 μm para um amostrador automático. Utilizando um sistema de CLAE Shimadzu (duas bombas LC 20AD; amostrador automático SIL 20A; desgaseificador DGU 20As; detector UV-VIS SPD-20A para monitoramento a 237 nm; e módulo de comunicação CBM-20A), o teor de glucosinolatos na farinha de sementes foi determinado em triplicata. Utilizou-se o software Shimadzu LC Solution versão 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, EUA). A coluna utilizada foi uma coluna de fase reversa C18 Inertsil (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, EUA). As condições iniciais da fase móvel foram definidas em 12% de metanol/88% de hidróxido de tetrabutilamônio 0,01 M em água (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) com uma vazão de 1 mL/min. Após a injeção de 15 μL da amostra, as condições iniciais foram mantidas por 20 minutos e, em seguida, a proporção de solvente foi ajustada para 100% de metanol, com um tempo total de análise da amostra de 65 minutos. Uma curva padrão (baseada em nM/mAb) foi gerada por diluições seriadas de padrões recém-preparados de sinapina, glucosinolatos e mirosina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) para estimar o teor de enxofre da farinha de sementes desengorduradas. As concentrações de glucosinolatos nas amostras foram analisadas em um HPLC Agilent 1100 (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) utilizando o software OpenLAB CDS ChemStation versão (C.01.07 SR2 [255]) equipado com a mesma coluna e utilizando um método previamente descrito. As concentrações de glucosinolatos foram determinadas para serem comparáveis entre os sistemas de HPLC.
O isotiocianato de alila (94%, estável) e o isotiocianato de benzila (98%) foram adquiridos da Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). O 4-hidroxibenzilisotiocianato foi adquirido da ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). Quando hidrolisados enzimaticamente pela mirosinase, os glucosinolatos formam isotiocianato de alila, isotiocianato de benzila e 4-hidroxibenzilisotiocianato, respectivamente.
Os bioensaios laboratoriais foram realizados de acordo com o método de Muturi et al. 32, com modificações. Cinco farinhas de sementes com baixo teor de gordura foram utilizadas no estudo: DFP, DFP-HT, IG, PG e Ls. Vinte larvas foram colocadas em um béquer descartável de três vias de 400 mL (VWR International, LLC, Radnor, PA, EUA) contendo 120 mL de água deionizada (dH2O). Sete concentrações de farinha de sementes foram testadas quanto à toxicidade para larvas de mosquito: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 e 0,12 g de farinha de sementes/120 mL de dH2O para as farinhas de sementes DFP, DFP-HT, IG e PG. Os bioensaios preliminares indicam que a farinha de sementes de Ls desengordurada é mais tóxica do que as outras quatro farinhas de sementes testadas. Portanto, ajustamos as sete concentrações de tratamento da farinha de sementes de Ls para as seguintes concentrações: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 e 0,075 g/120 mL de água destilada.
Um grupo controle não tratado (dH20, sem suplemento de farinha de sementes) foi incluído para avaliar a mortalidade normal dos insetos nas condições do ensaio. Os bioensaios toxicológicos para cada farinha de sementes incluíram três réplicas em béqueres de três inclinações (20 larvas de terceiro instar tardio por béquer), totalizando 108 frascos. Os recipientes tratados foram armazenados à temperatura ambiente (20-21 °C) e a mortalidade larval foi registrada durante 24 e 72 horas de exposição contínua às concentrações de tratamento. Se o corpo e os apêndices do mosquito não se moverem ao serem perfurados ou tocados com uma espátula fina de aço inoxidável, as larvas são consideradas mortas. As larvas mortas geralmente permanecem imóveis em posição dorsal ou ventral no fundo do recipiente ou na superfície da água. O experimento foi repetido três vezes em dias diferentes, utilizando diferentes grupos de larvas, totalizando 180 larvas expostas a cada concentração de tratamento.
A toxicidade do AITC, BITC e 4-HBITC para larvas de mosquito foi avaliada utilizando o mesmo procedimento de bioensaio, porém com diferentes tratamentos. Prepare soluções estoque de 100.000 ppm para cada composto químico adicionando 100 µL do composto a 900 µL de etanol absoluto em um tubo de centrífuga de 2 mL e agitando por 30 segundos para homogeneizar a mistura. As concentrações de tratamento foram determinadas com base em nossos bioensaios preliminares, que demonstraram que o BITC é muito mais tóxico que o AITC e o 4-HBITC. Para determinar a toxicidade, foram utilizadas 5 concentrações de BITC (1, 3, 6, 9 e 12 ppm), 7 concentrações de AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35 ppm) e 6 concentrações de 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 e 35 ppm). 30, 45, 60, 75 e 90 ppm). O tratamento controle foi injetado com 108 μL de etanol absoluto, o que equivale ao volume máximo do tratamento químico. Os bioensaios foram repetidos conforme descrito acima, expondo um total de 180 larvas por concentração de tratamento. A mortalidade larval foi registrada para cada concentração de AITC, BITC e 4-HBITC após 24 h de exposição contínua.
A análise Probit de 65 dados de mortalidade relacionados à dose foi realizada utilizando o software Polo (Polo Plus, LeOra Software, versão 1.0) para calcular a concentração letal de 50% (CL50), a concentração letal de 90% (CL90), a inclinação, o coeficiente de dose letal e a concentração letal de 95%, com base nos intervalos de confiança para as razões de dose letal para a concentração transformada em logaritmo e as curvas de dose-mortalidade. Os dados de mortalidade são baseados em dados replicados combinados de 180 larvas expostas a cada concentração de tratamento. As análises probabilísticas foram realizadas separadamente para cada farinha de semente e cada componente químico. Com base no intervalo de confiança de 95% da razão de dose letal, a toxicidade da farinha de semente e dos constituintes químicos para as larvas de mosquito foi considerada significativamente diferente, portanto, um intervalo de confiança contendo o valor 1 não foi considerado significativamente diferente (p = 0,0566).
Os resultados da HPLC para a determinação dos principais glucosinolatos nas farinhas de sementes desengorduradas DFP, IG, PG e Ls estão listados na Tabela 1. Os principais glucosinolatos nas farinhas de sementes testadas variaram, com exceção de DFP e PG, que continham glucosinolatos de mirosinase. O teor de mirosinina em PG foi maior do que em DFP, 33,3 ± 1,5 e 26,5 ± 0,9 mg/g, respectivamente. O pó de sementes de Ls continha 36,6 ± 1,2 mg/g de glicoglicona, enquanto o pó de sementes de IG continha 38,0 ± 0,5 mg/g de sinapina.
Larvas de mosquitos Ae. Aedes aegypti foram mortas quando tratadas com farinha de sementes desengorduradas, embora a eficácia do tratamento tenha variado dependendo da espécie vegetal. Apenas a farinha de sementes desengorduradas (DFP-NT) não foi tóxica para as larvas de mosquito após 24 e 72 horas de exposição (Tabela 2). A toxicidade do pó de sementes ativo aumentou com o aumento da concentração (Fig. 1A, B). A toxicidade da farinha de sementes para as larvas de mosquito variou significativamente com base no intervalo de confiança de 95% da razão da dose letal (CL50) nas avaliações de 24 e 72 horas (Tabela 3). Após 24 horas, o efeito tóxico da farinha de sementes de Ls foi maior do que o dos outros tratamentos com farinha de sementes, apresentando a maior atividade e toxicidade máxima para as larvas (CL50 = 0,04 g/120 ml de água desengordurada). As larvas apresentaram menor sensibilidade ao DFP após 24 horas em comparação com os tratamentos com pó de sementes de IG, Ls e PG, com valores de CL50 de 0,115, 0,04 e 0,08 g/120 ml de água destilada, respectivamente, que foram estatisticamente superiores ao valor de CL50 de 0,211 g/120 ml de água destilada (Tabela 3). Os valores de CL90 para DFP, IG, PG e Ls foram de 0,376, 0,275, 0,137 e 0,074 g/120 ml de água destilada, respectivamente (Tabela 2). A maior concentração de DPP foi de 0,12 g/120 ml de água destilada. Após 24 horas de avaliação, a mortalidade média das larvas foi de apenas 12%, enquanto a mortalidade média das larvas tratadas com IG e PG atingiu 51% e 82%, respectivamente. Após 24 horas de avaliação, a mortalidade larval média para o tratamento com a maior concentração de farinha de sementes de Ls (0,075 g/120 ml de água destilada) foi de 99% (Fig. 1A).
As curvas de mortalidade foram estimadas a partir da resposta à dose (Probit) de larvas de Ae. Egyptian (larvas de 3º instar) à concentração de farinha de sementes 24 horas (A) e 72 horas (B) após o tratamento. A linha pontilhada representa a CL50 do tratamento com farinha de sementes. DFP: Thlaspi arvense, DFP-HT: Thlaspi arvense inativado pelo calor, IG: Sinapsis alba (Ida Gold), PG: Brassica juncea (Pacific Gold), Ls: Lepidium sativum.
Após 72 horas de avaliação, os valores de CL50 das farinhas de sementes de DFP, IG e PG foram de 0,111, 0,085 e 0,051 g/120 ml de água destilada, respectivamente. Quase todas as larvas expostas à farinha de sementes de Ls morreram após 72 horas de exposição, portanto, os dados de mortalidade foram inconsistentes com a análise Probit. Comparadas às outras farinhas de sementes, as larvas foram menos sensíveis ao tratamento com farinha de sementes de DFP e apresentaram valores de CL50 estatisticamente mais altos (Tabelas 2 e 3). Após 72 horas, os valores de CL50 para os tratamentos com farinha de sementes de DFP, IG e PG foram estimados em 0,111, 0,085 e 0,05 g/120 ml de água destilada, respectivamente. Após 72 horas de avaliação, os valores de CL90 dos pós de sementes de DFP, IG e PG foram de 0,215, 0,254 e 0,138 g/120 ml de água destilada, respectivamente. Após 72 horas de avaliação, a mortalidade larval média para os tratamentos com farinha de sementes de DFP, IG e PG, na concentração máxima de 0,12 g/120 ml de água destilada, foi de 58%, 66% e 96%, respectivamente (Fig. 1B). Após 72 horas de avaliação, a farinha de sementes de PG apresentou maior toxicidade do que as farinhas de sementes de IG e DFP.
Os isotiocianatos sintéticos, isotiocianato de alila (AITC), isotiocianato de benzila (BITC) e 4-hidroxibenzilisotiocianato (4-HBITC), podem matar larvas de mosquito de forma eficaz. Após 24 horas do tratamento, o BITC apresentou maior toxicidade para as larvas, com um valor de CL50 de 5,29 ppm, comparado a 19,35 ppm para o AITC e 55,41 ppm para o 4-HBITC (Tabela 4). Em comparação com o AITC e o BITC, o 4-HBITC apresenta menor toxicidade e um valor de CL50 mais elevado. Observam-se diferenças significativas na toxicidade larval dos dois principais isotiocianatos (Ls e PG) na farinha de sementes mais potente. A toxicidade, baseada na razão da dose letal dos valores de CL50 entre AITC, BITC e 4-HBITC, mostrou uma diferença estatística, de modo que o IC de 95% da razão da dose letal de CL50 não incluiu o valor 1 (P = 0,05, Tabela 4). Estimou-se que as concentrações mais elevadas de BITC e AITC matariam 100% das larvas testadas (Figura 2).
As curvas de mortalidade foram estimadas a partir da relação dose-resposta (Probit) de Ae. 24 horas após o tratamento, larvas egípcias (larvas de 3º instar) atingiram concentrações sintéticas de isotiocianato. A linha pontilhada representa a CL50 para o tratamento com isotiocianato. Isotiocianato de benzila (BITC), isotiocianato de alila (AITC) e 4-HBITC.
O uso de biopesticidas vegetais como agentes de controle de vetores de mosquitos tem sido estudado há muito tempo. Muitas plantas produzem substâncias químicas naturais com atividade inseticida37. Seus compostos bioativos oferecem uma alternativa atraente aos inseticidas sintéticos, com grande potencial no controle de pragas, incluindo mosquitos.
A mostarda é cultivada para a produção de sementes, utilizadas como especiaria e fonte de óleo. Quando o óleo de mostarda é extraído das sementes ou quando a mostarda é extraída para uso como biocombustível, o subproduto é a farinha de sementes desengordurada. Essa farinha de sementes retém muitos de seus componentes bioquímicos naturais e enzimas hidrolíticas. A toxicidade dessa farinha de sementes é atribuída à produção de isotiocianatos. Os isotiocianatos são formados pela hidrólise de glucosinolatos pela enzima mirosinase durante a hidratação da farinha de sementes e são conhecidos por apresentarem efeitos fungicidas, bactericidas, nematicidas e inseticidas, além de outras propriedades, incluindo efeitos sensoriais químicos e propriedades quimioterapêuticas. Diversos estudos demonstraram que a mostarda e sua farinha atuam eficazmente como fumigantes contra pragas do solo e de alimentos armazenados. Neste estudo, avaliamos a toxicidade da farinha de quatro sementes e seus três produtos bioativos, AITC, BITC e 4-HBITC, para larvas do mosquito Aedes aegypti. A adição direta da farinha de sementes à água contendo larvas de mosquito deve ativar processos enzimáticos que produzem isotiocianatos tóxicos para as larvas. Essa biotransformação foi demonstrada, em parte, pela atividade larvicida observada na farinha de sementes e pela perda dessa atividade inseticida quando a farinha de sementes de mostarda-anã foi tratada termicamente antes do uso. O tratamento térmico deve destruir as enzimas hidrolíticas que ativam os glucosinolatos, impedindo assim a formação de isotiocianatos bioativos. Este é o primeiro estudo a confirmar as propriedades inseticidas do pó de sementes de repolho contra mosquitos em ambiente aquático.
Dentre os pós de sementes testados, o pó de sementes de agrião (Ls) foi o mais tóxico, causando alta mortalidade em larvas de Aedes albopictus. As larvas de Aedes aegypti foram processadas continuamente por 24 horas. Os outros três pós de sementes (PG, IG e DFP) apresentaram atividade mais lenta e ainda causaram mortalidade significativa após 72 horas de tratamento contínuo. Apenas a farinha de sementes de Ls continha quantidades significativas de glucosinolatos, enquanto PG e DFP continham mirosinase e IG continha glucosinolato como principal componente (Tabela 1). A glucotropaeolina é hidrolisada em BITC e a sinalbina é hidrolisada em 4-HBITC61,62. Nossos resultados de bioensaio indicam que tanto a farinha de sementes de Ls quanto o BITC sintético são altamente tóxicos para larvas de mosquito. O principal componente das farinhas de sementes de PG e DFP é o glucosinolato da mirosinase, que é hidrolisado em AITC. O AITC é eficaz na eliminação de larvas de mosquito, com um valor de CL50 de 19,35 ppm. Comparado ao AITC e ao BITC, o isotiocianato de 4-HBITC é o menos tóxico para as larvas. Embora o AITC seja menos tóxico que o BITC, seus valores de CL50 são menores do que os de muitos óleos essenciais testados em larvas de mosquito32,73,74,75.
Nosso pó de sementes crucíferas para uso contra larvas de mosquito contém um glucosinolato principal, representando mais de 98-99% do total de glucosinolatos, conforme determinado por HPLC. Traços de outros glucosinolatos foram detectados, mas seus níveis representaram menos de 0,3% do total de glucosinolatos. O pó de sementes de agrião (L. sativum) contém glucosinolatos secundários (sinigrina), mas sua proporção é de 1% do total de glucosinolatos, e seu teor ainda é insignificante (cerca de 0,4 mg/g de pó de sementes). Embora o PG e o DFP contenham o mesmo glucosinolato principal (mirosina), a atividade larvicida de suas farinhas de sementes difere significativamente devido aos seus valores de CL50. Varia em toxicidade para oídio. A emergência de larvas de Aedes aegypti pode ser devida a diferenças na atividade ou estabilidade da mirosinase entre as duas farinhas de sementes. A atividade da mirosinase desempenha um papel importante na biodisponibilidade de produtos de hidrólise, como isotiocianatos, em plantas Brassicaceae76. Relatórios anteriores de Pocock et al.77 e Wilkinson et al.78 mostraram que alterações na atividade e estabilidade da mirosinase também podem estar associadas a fatores genéticos e ambientais.
O teor esperado de isotiocianatos bioativos foi calculado com base nos valores de CL50 de cada farinha de sementes após 24 e 72 horas (Tabela 5), para comparação com as aplicações químicas correspondentes. Após 24 horas, os isotiocianatos presentes na farinha de sementes apresentaram maior toxicidade do que os compostos puros. Os valores de CL50 calculados com base em partes por milhão (ppm) dos tratamentos com isotiocianatos nas sementes foram inferiores aos valores de CL50 para as aplicações de BITC, AITC e 4-HBITC. Observamos larvas consumindo os grânulos de farinha de sementes (Figura 3A). Consequentemente, as larvas podem ter recebido uma exposição mais concentrada aos isotiocianatos tóxicos ao ingerirem os grânulos de farinha de sementes. Isso foi mais evidente nos tratamentos com farinha de sementes IG e PG após 24 horas de exposição, nos quais as concentrações de CL50 foram 75% e 72% menores do que nos tratamentos com AITC e 4-HBITC puros, respectivamente. Os tratamentos com Ls e DFP foram mais tóxicos do que o isotiocianato puro, com valores de CL50 24% e 41% menores, respectivamente. As larvas no tratamento controle puparam com sucesso (Fig. 3B), enquanto a maioria das larvas no tratamento com farinha de sementes não pupou e o desenvolvimento larval foi significativamente atrasado (Fig. 3B,D). Em Spodopteralitura, os isotiocianatos estão associados ao retardo do crescimento e ao atraso no desenvolvimento79.
Larvas de mosquitos Ae. Aedes aegypti foram expostas continuamente ao pó de sementes de Brassica por 24 a 72 horas. (A) Larvas mortas com partículas de farinha de sementes nas peças bucais (circuladas); (B) O tratamento controle (água destilada sem adição de farinha de sementes) mostra que as larvas crescem normalmente e começam a pupar após 72 horas; (C, D) Larvas tratadas com farinha de sementes apresentaram diferenças no desenvolvimento e não puparam.
Não estudamos o mecanismo dos efeitos tóxicos dos isotiocianatos em larvas de mosquito. No entanto, estudos anteriores em formigas-de-fogo-vermelhas (Solenopsis invicta) mostraram que a inibição da glutationa S-transferase (GST) e da esterase (EST) é o principal mecanismo da bioatividade dos isotiocianatos, e o AITC, mesmo em baixa atividade, também pode inibir a atividade da GST em formigas-de-fogo-vermelhas importadas em baixas concentrações. A dose é de 0,5 µg/ml80. Em contraste, o AITC inibe a acetilcolinesterase em gorgulhos-do-milho adultos (Sitophilus zeamais)81. Estudos semelhantes devem ser realizados para elucidar o mecanismo da atividade dos isotiocianatos em larvas de mosquito.
Utilizamos o tratamento com DFP inativado pelo calor para corroborar a hipótese de que a hidrólise de glucosinolatos vegetais para formar isotiocianatos reativos serve como mecanismo de controle de larvas de mosquito pela farinha de sementes de mostarda. A farinha de sementes de mostarda tratada com DFP e submetida a tratamento térmico não apresentou toxicidade nas taxas de aplicação testadas. Lafarga et al.82 relataram que os glucosinolatos são sensíveis à degradação em altas temperaturas. Espera-se também que o tratamento térmico desnature a enzima mirosinase na farinha de sementes e impeça a hidrólise dos glucosinolatos para formar isotiocianatos reativos. Isso também foi confirmado por Okunade et al.75, que demonstraram que a mirosinase é sensível à temperatura, apresentando atividade completamente inativada quando sementes de mostarda, mostarda-preta e sanguinaria foram expostas a temperaturas acima de 80 °C. Esses mecanismos podem resultar na perda da atividade inseticida da farinha de sementes de mostarda tratada com DFP e submetida a tratamento térmico.
Assim, a farinha de semente de mostarda e seus três principais isotiocianatos são tóxicos para larvas de mosquito. Dadas essas diferenças entre a farinha de semente e os tratamentos químicos, o uso da farinha de semente pode ser um método eficaz para o controle de mosquitos. Há necessidade de identificar formulações adequadas e sistemas de aplicação eficazes para melhorar a eficácia e a estabilidade do uso do pó de semente. Nossos resultados indicam o potencial do uso da farinha de semente de mostarda como alternativa aos pesticidas sintéticos. Essa tecnologia pode se tornar uma ferramenta inovadora para o controle de vetores de mosquitos. Como as larvas de mosquito prosperam em ambientes aquáticos e os glucosinolatos da farinha de semente são convertidos enzimaticamente em isotiocianatos ativos após a hidratação, o uso da farinha de semente de mostarda em água infestada por mosquitos oferece um potencial significativo de controle. Embora a atividade larvicida dos isotiocianatos varie (BITC > AITC > 4-HBITC), mais pesquisas são necessárias para determinar se a combinação da farinha de semente com múltiplos glucosinolatos aumenta sinergicamente a toxicidade. Este é o primeiro estudo a demonstrar os efeitos inseticidas da farinha de sementes de crucíferas desengorduradas e de três isotiocianatos bioativos sobre mosquitos. Os resultados deste estudo são inovadores, mostrando que a farinha de sementes de repolho desengorduradas, um subproduto da extração de óleo das sementes, pode servir como um promissor agente larvicida para o controle de mosquitos. Esta informação pode contribuir para o avanço da descoberta de agentes de biocontrole de origem vegetal e seu desenvolvimento como biopesticidas baratos, práticos e ecologicamente corretos.
Os conjuntos de dados gerados para este estudo e as análises resultantes estão disponíveis mediante solicitação razoável ao autor correspondente. Ao final do estudo, todos os materiais utilizados (insetos e farinha de sementes) foram destruídos.
Data da publicação: 29/07/2024