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Combinações de compostos inseticidas derivados de plantas podem apresentar interações sinérgicas ou antagônicas contra pragas. Considerando a rápida disseminação de doenças transmitidas por mosquitos Aedes e a crescente resistência das populações desses mosquitos aos inseticidas tradicionais, vinte e oito combinações de compostos terpênicos à base de óleos essenciais de plantas foram formuladas e testadas contra os estágios larval e adulto de Aedes aegypti. Cinco óleos essenciais (OEs) de plantas foram inicialmente avaliados quanto à sua eficácia larvicida e contra adultos, e dois compostos principais foram identificados em cada OE com base em resultados de GC-MS. Os principais compostos identificados foram adquiridos comercialmente, a saber: dissulfeto de dialila, trissulfeto de dialila, carvona, limoneno, eugenol, metil eugenol, eucaliptol, eudesmol e alfa-pineno de mosquito. Combinações binárias desses compostos foram então preparadas utilizando doses subletais, e seus efeitos sinérgicos e antagônicos foram testados e determinados. As melhores composições larvicidas são obtidas pela mistura de limoneno com dissulfeto de dialila, e as melhores composições adulticidas são obtidas pela mistura de carvona com limoneno. O larvicida sintético Temphos, usado comercialmente, e o medicamento para adultos Malathion foram testados separadamente e em combinações binárias com terpenoides. Os resultados mostraram que a combinação de temefós com dissulfeto de dialila e a combinação de malation com eudesmol foram as mais eficazes. Essas combinações potentes apresentam potencial para uso contra Aedes aegypti.
Os óleos essenciais (OE) de plantas são metabólitos secundários que contêm diversos compostos bioativos e estão se tornando cada vez mais importantes como alternativa aos pesticidas sintéticos. Além de serem ecologicamente corretos e fáceis de usar, eles também são uma mistura de diferentes compostos bioativos, o que reduz a probabilidade de desenvolvimento de resistência a medicamentos¹. Utilizando a tecnologia GC-MS, pesquisadores examinaram os constituintes de vários óleos essenciais de plantas e identificaram mais de 3.000 compostos em 17.500 plantas aromáticas², a maioria dos quais foi testada quanto às suas propriedades inseticidas e apresenta efeitos inseticidas comprovados³.⁴ Alguns estudos destacam que a toxicidade do componente principal do composto é igual ou maior que a do óxido de etileno bruto. No entanto, o uso de compostos individuais pode, novamente, abrir espaço para o desenvolvimento de resistência, como ocorre com os inseticidas químicos⁵.⁶ Portanto, o foco atual está na preparação de misturas de compostos à base de óxido de etileno para melhorar a eficácia inseticida e reduzir a probabilidade de resistência em populações de pragas-alvo. Os compostos ativos individuais presentes nos óleos essenciais podem apresentar efeitos sinérgicos ou antagônicos em combinações que refletem a atividade geral do óleo essencial, um fato que foi bem enfatizado em estudos conduzidos por pesquisadores anteriores7,8. O programa de controle vetorial também inclui óleos essenciais e seus componentes. A atividade mosquitocida dos óleos essenciais tem sido extensivamente estudada em mosquitos Culex e Anopheles. Diversos estudos têm tentado desenvolver pesticidas eficazes combinando várias plantas com pesticidas sintéticos comercialmente utilizados para aumentar a toxicidade geral e minimizar os efeitos colaterais9. No entanto, estudos sobre tais compostos contra o Aedes aegypti ainda são raros. Os avanços na ciência médica e o desenvolvimento de medicamentos e vacinas têm ajudado a combater algumas doenças transmitidas por vetores. Contudo, a presença de diferentes sorotipos do vírus transmitido pelo mosquito Aedes aegypti tem levado ao fracasso dos programas de vacinação. Portanto, quando essas doenças ocorrem, os programas de controle vetorial são a única opção para prevenir a disseminação da doença. No cenário atual, o controle do Aedes aegypti é crucial, visto que este é um vetor chave de diversos vírus e seus sorotipos, causadores de dengue, zika, dengue hemorrágica, febre amarela, entre outras doenças. O mais preocupante é o aumento anual no número de casos de quase todas as doenças transmitidas pelo Aedes, tanto no Egito quanto em todo o mundo. Portanto, nesse contexto, há uma necessidade urgente de desenvolver medidas de controle ambientalmente amigáveis e eficazes para as populações de Aedes aegypti. Potenciais candidatos nesse sentido são os óleos essenciais, seus compostos constituintes e suas combinações. Assim, este estudo buscou identificar combinações sinérgicas eficazes de compostos de óleos essenciais de cinco plantas com propriedades inseticidas (hortelã, manjericão-santo, eucalipto-manchado, alho-poró e melaleuca) contra o Aedes aegypti.
Todos os óleos essenciais selecionados demonstraram potencial atividade larvicida contra Aedes aegypti, com CL50 de 24 h variando de 0,42 a 163,65 ppm. A maior atividade larvicida foi registrada para o óleo essencial de hortelã-pimenta (Mp), com um valor de CL50 de 0,42 ppm em 24 h, seguido pelo óleo essencial de alho (As), com um valor de CL50 de 16,19 ppm em 24 h (Tabela 1).
Com exceção do óleo essencial de Ocimum sainttum (Os), todos os outros quatro óleos essenciais analisados apresentaram efeitos alergênicos evidentes, com valores de CL50 variando de 23,37 a 120,16 ppm durante o período de exposição de 24 horas. O óleo essencial de Thymophilus striata (Cl) foi o mais eficaz na eliminação de adultos, com um valor de CL50 de 23,37 ppm em 24 horas de exposição, seguido pelo óleo essencial de Eucalyptus maculata (Em), que apresentou um valor de CL50 de 101,91 ppm (Tabela 1). Por outro lado, o valor de CL50 para Os ainda não foi determinado, visto que a maior taxa de mortalidade, de 53%, foi registrada na dose mais alta (Figura Suplementar 3).
Os dois principais compostos constituintes de cada óleo essencial foram identificados e selecionados com base nos resultados do banco de dados da biblioteca NIST, na porcentagem da área do cromatograma de GC e nos resultados dos espectros de MS (Tabela 2). Para o óleo essencial As, os principais compostos identificados foram dissulfeto de dialila e trissulfeto de dialila; para o óleo essencial Mp, os principais compostos identificados foram carvona e limoneno; para o óleo essencial Em, os principais compostos identificados foram eudesmol e eucaliptol; para o óleo essencial Os, os principais compostos identificados foram eugenol e metil eugenol; e para o óleo essencial Cl, os principais compostos identificados foram eugenol e α-pineno (Figura 1, Figuras Suplementares 5–8, Tabelas Suplementares 1–5).
Resultados da espectrometria de massa dos principais terpenoides de óleos essenciais selecionados (A-dissulfeto de dialila; B-trissulfeto de dialila; C-eugenol; D-metil eugenol; E-limoneno; F-ceperona aromática; G-α-pineno; H-cineol; R-eudamol).
Um total de nove compostos (dissulfeto de dialila, trissulfeto de dialila, eugenol, metil eugenol, carvona, limoneno, eucaliptol, eudesmol e α-pineno) foram identificados como compostos eficazes, sendo os principais componentes do óleo essencial, e foram bioensaiados individualmente contra Aedes aegypti em estágios larvais. O composto eudesmol apresentou a maior atividade larvicida, com um valor de CL50 de 2,25 ppm após 24 horas de exposição. Os compostos dissulfeto de dialila e trissulfeto de dialila também demonstraram potencial efeito larvicida, com doses subletais médias na faixa de 10 a 20 ppm. Atividade larvicida moderada foi observada para os compostos eugenol, limoneno e eucaliptol, com valores de CL50 de 63,35 ppm e 139,29 ppm, respectivamente. e 181,33 ppm após 24 horas, respectivamente (Tabela 3). No entanto, não foi encontrado potencial larvicida significativo do metil eugenol e da carvona, mesmo nas doses mais elevadas, portanto, os valores de CL50 não foram calculados (Tabela 3). O larvicida sintético Temefós apresentou uma concentração letal média de 0,43 ppm contra Aedes aegypti após 24 horas de exposição (Tabela 3, Tabela Suplementar 6).
Sete compostos (dissulfeto de dialila, trissulfeto de dialila, eucaliptol, α-pineno, eudesmol, limoneno e carvona) foram identificados como os principais compostos do óleo essencial eficaz e testados individualmente contra mosquitos Aedes egípcios adultos. De acordo com a análise de regressão Probit, o eudesmol apresentou o maior potencial, com um valor de CL50 de 1,82 ppm, seguido pelo eucaliptol, com um valor de CL50 de 17,60 ppm após 24 horas de exposição. Os cinco compostos restantes testados apresentaram potencial moderadamente prejudicial para adultos, com valores de CL50 variando de 140,79 a 737,01 ppm (Tabela 3). O organofosforado sintético malation foi menos potente que o eudesmol e mais potente que os outros seis compostos, com um valor de CL50 de 5,44 ppm durante o período de exposição de 24 horas (Tabela 3, Tabela Suplementar 6).
Sete compostos líderes potentes e o organofosforado tamefosato foram selecionados para formular combinações binárias de suas doses LC50 em uma proporção de 1:1. Um total de 28 combinações binárias foram preparadas e testadas quanto à sua eficácia larvicida contra Aedes aegypti. Nove combinações mostraram-se sinérgicas, 14 combinações foram antagônicas e cinco combinações não apresentaram atividade larvicida. Dentre as combinações sinérgicas, a combinação de dissulfeto de dialila e temofol foi a mais eficaz, com 100% de mortalidade observada após 24 horas (Tabela 4). De forma semelhante, misturas de limoneno com dissulfeto de dialila e eugenol com timefos apresentaram bom potencial, com uma mortalidade larval observada de 98,3% (Tabela 5). As quatro combinações restantes, a saber, eudesmol mais eucaliptol, eudesmol mais limoneno, eucaliptol mais alfa-pineno e alfa-pineno mais temefós, também apresentaram eficácia larvicida significativa, com taxas de mortalidade observadas superiores a 90%. A taxa de mortalidade esperada é próxima de 60-75% (Tabela 4). No entanto, a combinação de limoneno com α-pineno ou eucalipto apresentou reações antagônicas. Da mesma forma, misturas de temefós com eugenol, eucalipto, eudesmol ou trissulfeto de dialila também apresentaram efeitos antagônicos. Similarmente, a combinação de dissulfeto de dialila e trissulfeto de dialila, bem como a combinação de qualquer um desses compostos com eudesmol ou eugenol, são antagônicas em sua ação larvicida. Antagonismo também foi relatado com a combinação de eudesmol com eugenol ou α-pineno.
Das 28 misturas binárias testadas quanto à atividade ácida em adultos, 7 combinações foram sinérgicas, 6 não apresentaram efeito e 15 foram antagônicas. Misturas de eudesmol com eucalipto e limoneno com carvona mostraram-se mais eficazes do que outras combinações sinérgicas, com taxas de mortalidade em 24 horas de 76% e 100%, respectivamente (Tabela 5). Observou-se que o malation exibe efeito sinérgico com todas as combinações de compostos, exceto limoneno e trissulfeto de dialila. Por outro lado, foi observado antagonismo entre o dissulfeto de dialila e o trissulfeto de dialila e a combinação de qualquer um deles com eucalipto, eucaliptol, carvona ou limoneno. Da mesma forma, combinações de α-pineno com eudesmol ou limoneno, eucaliptol com carvona ou limoneno e limoneno com eudesmol ou malation apresentaram efeitos larvicidas antagônicos. Para as seis combinações restantes, não houve diferença significativa entre a mortalidade esperada e a observada (Tabela 5).
Com base nos efeitos sinérgicos e nas doses subletais, a toxicidade larvicida contra um grande número de mosquitos Aedes aegypti foi selecionada e testada. Os resultados mostraram que a mortalidade larval observada com as combinações binárias eugenol-limoneno, dissulfeto de dialila-limoneno e dissulfeto de dialila-timephos foi de 100%, enquanto a mortalidade larval esperada foi de 76,48%, 72,16% e 63,4%, respectivamente (Tabela 6). A combinação de limoneno e eudesmol foi relativamente menos eficaz, com 88% de mortalidade larval observada durante o período de exposição de 24 horas (Tabela 6). Em resumo, as quatro combinações binárias selecionadas também demonstraram efeitos larvicidas sinérgicos contra Aedes aegypti quando aplicadas em larga escala (Tabela 6).
Três combinações sinérgicas foram selecionadas para o bioensaio adulticida com o objetivo de controlar grandes populações de Aedes aegypti adultos. Para selecionar as combinações a serem testadas em grandes colônias de insetos, focamos inicialmente nas duas melhores combinações sinérgicas de terpenos: carvona mais limoneno e eucaliptol mais eudesmol. Em seguida, a melhor combinação sinérgica foi selecionada dentre as combinações do organofosforado sintético malation e terpenoides. Acreditamos que a combinação de malation e eudesmol seja a melhor para testes em grandes colônias de insetos devido à maior mortalidade observada e aos baixíssimos valores de CL50 dos ingredientes candidatos. O malation demonstra sinergismo em combinação com α-pineno, dissulfeto de dialila, eucalipto, carvona e eudesmol. Contudo, ao analisarmos os valores de CL50, o eudesmol apresenta o menor valor (2,25 ppm). Os valores de CL50 calculados para malationa, α-pineno, dissulfeto de dialila, eucaliptol e carvona foram de 5,4, 716,55, 166,02, 17,6 e 140,79 ppm, respectivamente. Esses valores indicam que a combinação de malationa e eudesmol é a ideal em termos de dosagem. Os resultados mostraram que as combinações de carvona com limoneno e eudesmol com malationa apresentaram mortalidade observada de 100%, comparada à mortalidade esperada de 61% a 65%. Outra combinação, eudesmol com eucaliptol, apresentou uma taxa de mortalidade de 78,66% após 24 horas de exposição, comparada à taxa de mortalidade esperada de 60%. Todas as três combinações selecionadas demonstraram efeitos sinérgicos, mesmo quando aplicadas em larga escala contra Aedes aegypti adultos (Tabela 6).
Neste estudo, óleos essenciais (OE) de plantas selecionados, como Mp, As, Os, Em e Cl, mostraram efeitos letais promissores nos estágios larval e adulto de Aedes aegypti. O OE de Mp apresentou a maior atividade larvicida, com um valor de CL50 de 0,42 ppm, seguido pelos OE de As, Os e Em, com valores de CL50 inferiores a 50 ppm após 24 horas. Esses resultados são consistentes com estudos anteriores em mosquitos e outras moscas dípteras10,11,12,13,14. Embora a potência larvicida do Cl seja menor que a de outros óleos essenciais, com um valor de CL50 de 163,65 ppm após 24 horas, seu potencial contra adultos é o mais alto, com um valor de CL50 de 23,37 ppm após 24 horas. Os óleos essenciais de Mp, As e Em também apresentaram bom potencial alercida, com valores de CL50 na faixa de 100–120 ppm após 24 horas de exposição, porém relativamente inferiores à sua eficácia larvicida. Por outro lado, o óleo essencial de Os demonstrou efeito alercida insignificante mesmo na dose terapêutica mais alta. Assim, os resultados indicam que a toxicidade do óxido de etileno para as plantas pode variar dependendo do estágio de desenvolvimento dos mosquitos15. Depende também da taxa de penetração dos óleos essenciais no corpo do inseto, da sua interação com enzimas-alvo específicas e da capacidade de desintoxicação do mosquito em cada estágio de desenvolvimento16. Numerosos estudos demonstraram que o principal composto componente é um fator importante na atividade biológica do óxido de etileno, uma vez que representa a maioria dos compostos totais3,12,17,18. Portanto, consideramos dois compostos principais em cada óleo essencial. Com base nos resultados de GC-MS, o dissulfeto de dialila e o trissulfeto de dialila foram identificados como os principais compostos do óleo essencial de As, o que está de acordo com relatos anteriores19,20,21. Embora relatos anteriores tenham indicado que o mentol era um de seus principais compostos, a carvona e o limoneno foram novamente identificados como os principais compostos do óleo essencial de Mp22,23. O perfil de composição do óleo essencial de Os3 mostrou que o eugenol e o metil eugenol são os principais compostos, o que é semelhante às descobertas de pesquisadores anteriores16,24. O eucaliptol e o eucaliptol foram relatados como os principais compostos presentes no óleo da folha de Em, o que está de acordo com as descobertas de alguns pesquisadores25,26, mas em desacordo com as descobertas de Olalade et al.27. A predominância de cineol e α-pineno foi observada no óleo essencial de melaleuca, o que é semelhante a estudos anteriores28,29. Diferenças intraespecíficas na composição e concentração de óleos essenciais extraídos da mesma espécie vegetal em diferentes locais foram relatadas e também observadas neste estudo, influenciadas por condições geográficas de crescimento da planta, época de colheita, estágio de desenvolvimento ou idade da planta, aparecimento de quimiotipos, etc.22,30,31,32. Os principais compostos identificados foram então adquiridos e testados quanto aos seus efeitos larvicidas e sobre mosquitos adultos de Aedes aegypti. Os resultados mostraram que a atividade larvicida do dissulfeto de dialila foi comparável à do óleo essencial bruto. No entanto, a atividade do trissulfeto de dialila foi superior à do óleo essencial. Esses resultados são semelhantes aos obtidos por Kimbaris et al.33 em Culex philippines. Contudo, esses dois compostos não apresentaram boa atividade autocida contra os mosquitos-alvo, o que está de acordo com os resultados de Plata-Rueda et al.34 em Tenebrio molitor. O óxido de etileno (Os EO) é eficaz contra o estágio larval de Aedes aegypti, mas não contra o estágio adulto. Foi constatado que a atividade larvicida dos principais compostos individuais é menor do que a do Os EO bruto. Isso implica um papel para outros compostos e suas interações no óxido de etileno bruto. O metil eugenol isoladamente apresenta atividade insignificante, enquanto o eugenol isoladamente apresenta atividade larvicida moderada. Essa conclusão confirma, por um lado,35,36 e, por outro, contradiz as conclusões de pesquisadores anteriores.37,38 Diferenças nos grupos funcionais do eugenol e do metileugenol podem resultar em diferentes toxicidades para o mesmo inseto-alvo.39 O limoneno apresentou atividade larvicida moderada, enquanto o efeito da carvona foi insignificante. Da mesma forma, a toxicidade relativamente baixa do limoneno para insetos adultos e a alta toxicidade da carvona corroboram os resultados de alguns estudos anteriores,40 mas contradizem outros.41 A presença de ligações duplas em posições intracíclicas e exocíclicas pode aumentar os benefícios desses compostos como larvicidas3,41, enquanto a carvona, que é uma cetona com carbonos alfa e beta insaturados, pode apresentar maior potencial de toxicidade em adultos42. No entanto, as características individuais do limoneno e da carvona são muito inferiores às do EO Mp total (Tabela 1, Tabela 3). Entre os terpenoides testados, o eudesmol apresentou a maior atividade larvicida e contra adultos, com um valor de CL50 abaixo de 2,5 ppm, tornando-o um composto promissor para o controle de mosquitos Aedes. Seu desempenho é superior ao do EO Em completo, embora isso não esteja de acordo com os resultados de Cheng et al.40. O eudesmol é um sesquiterpeno com duas unidades de isopreno, menos volátil que monoterpenos oxigenados como o eucalipto e, portanto, com maior potencial como pesticida. O próprio eucaliptol apresenta maior atividade contra adultos do que contra larvas, e resultados de estudos anteriores tanto corroboram quanto refutam essa hipótese37,43,44. Sua atividade isolada é quase comparável à do óleo essencial completo de Clorofila. Outro monoterpeno bicíclico, o α-pineno, apresenta menor efeito sobre Aedes aegypti em adultos do que em larvas, o que é o oposto do efeito do óleo essencial completo de Clorofila. A atividade inseticida geral dos terpenoides é influenciada por sua lipofilicidade, volatilidade, ramificação de carbono, área de projeção, área superficial, grupos funcionais e suas posições45,46. Esses compostos podem agir destruindo acúmulos celulares, bloqueando a atividade respiratória, interrompendo a transmissão de impulsos nervosos, etc.47 O organofosforado sintético Temefós apresentou a maior atividade larvicida, com um valor de CL50 de 0,43 ppm, o que está de acordo com os dados de Lek-Utala48. A atividade do organofosforado sintético malation em adultos foi relatada em 5,44 ppm. Embora esses dois organofosforados tenham demonstrado respostas favoráveis contra cepas de laboratório de Aedes aegypti, a resistência dos mosquitos a esses compostos foi relatada em diferentes partes do mundo49. No entanto, não foram encontrados relatos semelhantes de desenvolvimento de resistência a medicamentos fitoterápicos50. Assim, os produtos botânicos são considerados alternativas potenciais aos pesticidas químicos em programas de controle de vetores.
O efeito larvicida foi testado em 28 combinações binárias (1:1) preparadas a partir de terpenoides potentes e terpenoides com timefos, sendo que 9 combinações apresentaram sinergismo, 14 foram antagônicas e 5 não apresentaram efeito. Por outro lado, no bioensaio de potência em adultos, 7 combinações apresentaram sinergismo, 15 foram antagônicas e 6 não apresentaram efeito. A razão pela qual certas combinações produzem um efeito sinérgico pode ser devido à interação simultânea dos compostos candidatos em diferentes vias importantes, ou à inibição sequencial de diferentes enzimas-chave de uma via biológica específica. A combinação de limoneno com dissulfeto de dialila, eucalipto ou eugenol apresentou sinergismo em aplicações de pequena e grande escala (Tabela 6), enquanto sua combinação com eucalipto ou α-pineno apresentou efeitos antagônicos sobre as larvas. Em média, o limoneno parece ser um bom sinergista, possivelmente devido à presença de grupos metil, boa penetração no estrato córneo e um mecanismo de ação diferente52,53. Já foi relatado que o limoneno pode causar efeitos tóxicos ao penetrar na cutícula dos insetos (toxicidade por contato), afetar o sistema digestivo (antialimentar) ou o sistema respiratório (atividade fumigante),54 enquanto fenilpropanoides como o eugenol podem afetar enzimas metabólicas55. Portanto, combinações de compostos com diferentes mecanismos de ação podem aumentar o efeito letal geral da mistura. O eucaliptol mostrou-se sinérgico com dissulfeto de dialila, eucalipto ou α-pineno, mas outras combinações com outros compostos não apresentaram efeito larvicida ou apresentaram efeito antagônico. Estudos iniciais mostraram que o eucaliptol possui atividade inibitória sobre a acetilcolinesterase (AChE), bem como sobre os receptores de octaamina e GABA56. Como os monoterpenos cíclicos, eucaliptol, eugenol, etc., podem ter o mesmo mecanismo de ação que sua atividade neurotóxica, 57 minimizando assim seus efeitos combinados por meio de inibição mútua. Da mesma forma, a combinação de Temephos com dissulfeto de dialila, α-pineno e limoneno mostrou-se sinérgica, corroborando relatos anteriores de efeito sinérgico entre produtos fitoterápicos e organofosforados sintéticos.58
A combinação de eudesmol e eucaliptol demonstrou ter um efeito sinérgico nos estágios larval e adulto de Aedes aegypti, possivelmente devido aos seus diferentes modos de ação decorrentes de suas diferentes estruturas químicas. O eudesmol (um sesquiterpeno) pode afetar o sistema respiratório59 e o eucaliptol (um monoterpeno) pode afetar a acetilcolinesterase60. A coexposição dos ingredientes a dois ou mais locais-alvo pode aumentar o efeito letal geral da combinação. Em bioensaios com substâncias adultas, o malation demonstrou sinergia com carvona, eucaliptol, dissulfeto de dialila ou α-pineno, indicando que também apresenta sinergia com a adição de limoneno. Bons candidatos a alergênicos sinérgicos para todo o portfólio de compostos terpênicos, com exceção do trissulfeto de alila. Thangam e Kathiresan61 também relataram resultados semelhantes do efeito sinérgico do malation com extratos de ervas. Essa resposta sinérgica pode ser devida aos efeitos tóxicos combinados do malation e dos fitoquímicos sobre as enzimas de desintoxicação de insetos. Organofosforados como o malation geralmente atuam inibindo esterases e monooxigenases do citocromo P45062,63,64. Portanto, a combinação do malation com esses mecanismos de ação e terpenos com diferentes mecanismos de ação pode aumentar o efeito letal geral sobre os mosquitos.
Por outro lado, o antagonismo indica que os compostos selecionados são menos ativos em combinação do que cada composto isoladamente. A razão para o antagonismo em algumas combinações pode ser que um composto modifique o comportamento do outro, alterando a taxa de absorção, distribuição, metabolismo ou excreção. Os primeiros pesquisadores consideraram essa a causa do antagonismo em combinações de medicamentos. Moléculas Possível mecanismo 65. Da mesma forma, as possíveis causas do antagonismo podem estar relacionadas a mecanismos de ação semelhantes, competição dos compostos constituintes pelo mesmo receptor ou sítio alvo. Em alguns casos, também pode ocorrer inibição não competitiva da proteína alvo. Neste estudo, dois compostos organossulfurados, o dissulfeto de dialila e o trissulfeto de dialila, apresentaram efeitos antagônicos, possivelmente devido à competição pelo mesmo sítio alvo. Da mesma forma, esses dois compostos de enxofre apresentaram efeitos antagônicos e não tiveram efeito quando combinados com eudesmol e α-pineno. O eudesmol e o α-pineno são de natureza cíclica, enquanto o dissulfeto de dialila e o trissulfeto de dialila são de natureza alifática. Com base na estrutura química, a combinação desses compostos deveria aumentar a atividade letal geral, uma vez que seus sítios-alvo geralmente são diferentes34,47, mas experimentalmente encontramos antagonismo, o que pode ser devido ao papel desses compostos em alguns organismos desconhecidos in vivo. Da mesma forma, a combinação de cineol e α-pineno produziu respostas antagônicas, embora pesquisadores tenham relatado anteriormente que os dois compostos têm alvos de ação diferentes47,60. Como ambos os compostos são monoterpenos cíclicos, pode haver alguns sítios-alvo comuns que podem competir pela ligação e influenciar a toxicidade geral dos pares combinatórios estudados.
Com base nos valores de CL50 e na mortalidade observada, foram selecionadas as duas melhores combinações sinérgicas de terpenos: carvona + limoneno e eucaliptol + eudesmol, bem como o organofosforado sintético malation com terpenos. A combinação sinérgica ideal de malation + eudesmol foi testada em um bioensaio inseticida com adultos. O objetivo era atingir grandes colônias de insetos para confirmar se essas combinações eficazes seriam eficazes contra um grande número de indivíduos em áreas de exposição relativamente amplas. Todas as combinações demonstraram efeito sinérgico contra grandes enxames de insetos. Resultados semelhantes foram obtidos para uma combinação larvicida sinérgica ideal testada contra grandes populações de larvas de Aedes aegypti. Portanto, pode-se afirmar que a combinação sinérgica eficaz de compostos de óleos essenciais de plantas, com ação larvicida e adulticida, é uma forte candidata em relação aos produtos químicos sintéticos existentes e pode ser utilizada para o controle de populações de Aedes aegypti. Da mesma forma, combinações eficazes de larvicidas ou adulticidas sintéticos com terpenos também podem ser usadas para reduzir as doses de timetfos ou malation administradas aos mosquitos. Essas potentes combinações sinérgicas podem fornecer soluções para futuros estudos sobre a evolução da resistência a medicamentos em mosquitos Aedes.
Ovos de Aedes aegypti foram coletados no Centro Regional de Pesquisa Médica de Dibrugarh, Conselho Indiano de Pesquisa Médica, e mantidos sob temperatura (28 ± 1 °C) e umidade (85 ± 5%) controladas no Departamento de Zoologia da Universidade de Gauhati, nas seguintes condições: Arivoli et al. Após a eclosão, as larvas foram alimentadas com ração larval (farinha de biscoito para cães e levedura na proporção de 3:1) e os adultos com uma solução de glicose a 10%. A partir do terceiro dia após a emergência, as fêmeas adultas foram alimentadas com sangue de ratos albinos. Mergulhe papel de filtro em água em um copo e coloque-o na gaiola de postura de ovos.
Amostras selecionadas de plantas, nomeadamente folhas de eucalipto (Myrtaceae), manjericão-santo (Lamiaceae), hortelã (Lamiaceae), melaleuca (Myrtaceae) e bulbos de alho (Amaryllidaceae), foram coletadas em Guwahati e identificadas pelo Departamento de Botânica da Universidade de Gauhati. As amostras coletadas (500 g) foram submetidas à hidrodestilação utilizando um aparelho de Clevenger por 6 horas. O óleo essencial extraído foi coletado em frascos de vidro limpos e armazenado a 4 °C para estudos posteriores.
A toxicidade larvicida foi estudada utilizando procedimentos padrão da Organização Mundial da Saúde ligeiramente modificados67. Utilizou-se DMSO como emulsificante. Cada concentração de óleo essencial foi inicialmente testada a 100 e 1000 ppm, expondo 20 larvas em cada repetição. Com base nos resultados, foi aplicada uma faixa de concentração e a mortalidade foi registrada de 1 a 6 horas (em intervalos de 1 hora) e às 24, 48 e 72 horas após o tratamento. As concentrações subletais (CL50) foram determinadas após 24, 48 e 72 horas de exposição. Cada concentração foi testada em triplicata, juntamente com um controle negativo (apenas água) e um controle positivo (água tratada com DMSO). Se ocorrer pupação e mais de 10% das larvas do grupo controle morrerem, o experimento é repetido. Se a taxa de mortalidade no grupo controle estiver entre 5 e 10%, utiliza-se a fórmula de correção de Abbott68.
O método descrito por Ramar et al.69 foi utilizado para um bioensaio com mosquitos adultos de Aedes aegypti, utilizando acetona como solvente. Cada óleo essencial (OE) foi inicialmente testado contra mosquitos adultos de Aedes aegypti nas concentrações de 100 e 1000 ppm. Aplicou-se 2 ml de cada solução preparada em um pedaço de papel de filtro Whatman número 1 (tamanho 12 x 15 cm²) e deixou-se a acetona evaporar por 10 minutos. Um papel de filtro tratado apenas com 2 ml de acetona foi utilizado como controle. Após a evaporação da acetona, o papel de filtro tratado e o papel de filtro controle foram colocados em um tubo cilíndrico (10 cm de profundidade). Dez mosquitos de 3 a 4 dias de idade, não hematófagos, foram transferidos para cada concentração em triplicata. Com base nos resultados dos testes preliminares, diversas concentrações dos óleos selecionados foram testadas. A mortalidade foi registrada em 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas após a liberação dos mosquitos. Calcule os valores de CL50 para os tempos de exposição de 24 horas, 48 horas e 72 horas. Se a taxa de mortalidade do lote controle exceder 20%, repita todo o teste. Da mesma forma, se a taxa de mortalidade no grupo controle for superior a 5%, ajuste os resultados para as amostras tratadas utilizando a fórmula de Abbott68.
A cromatografia gasosa (Agilent 7890A) e a espectrometria de massa (Accu TOF GCv, Jeol) foram utilizadas para analisar os compostos constituintes dos óleos essenciais selecionados. O cromatógrafo gasoso estava equipado com um detector FID e uma coluna capilar (HP5-MS). O gás de arraste foi o hélio, com uma vazão de 1 ml/min. O programa GC define Allium sativum para 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M e Ocimum Sainttum para 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, para hortelã 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, para eucalipto 20.60-1M-10-200-3M-30-280 e para vermelho For a thousand layers they are them 10: 60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
Os principais compostos de cada óleo essencial foram identificados com base na porcentagem da área calculada a partir do cromatograma de GC e dos resultados da espectrometria de massa (com referência ao banco de dados de padrões NIST 70).
Os dois principais compostos de cada óleo essencial foram selecionados com base nos resultados de GC-MS e adquiridos da Sigma-Aldrich com pureza de 98–99% para bioensaios subsequentes. Os compostos foram testados quanto à eficácia larvicida e contra adultos de Aedes aegypti, conforme descrito anteriormente. Os larvicidas sintéticos mais comumente utilizados, tamefosato (Sigma Aldrich) e malationa (Sigma Aldrich), foram analisados para comparar sua eficácia com a dos compostos selecionados dos óleos essenciais, seguindo o mesmo procedimento.
Misturas binárias de compostos terpênicos selecionados e de compostos terpênicos com organofosforados comerciais (tilefos e malation) foram preparadas misturando-se a dose LC50 de cada composto candidato na proporção de 1:1. As combinações preparadas foram testadas em estágios larvais e adultos de Aedes aegypti, conforme descrito anteriormente. Cada bioensaio foi realizado em triplicata para cada combinação e em triplicata para os compostos individuais presentes em cada combinação. A mortalidade dos insetos-alvo foi registrada após 24 horas. Calcule a taxa de mortalidade esperada para uma mistura binária utilizando a seguinte fórmula.
onde E = taxa de mortalidade esperada de mosquitos Aedes aegypti em resposta a uma combinação binária, ou seja, a conexão (A + B).
O efeito de cada mistura binária foi classificado como sinérgico, antagônico ou sem efeito, com base no valor de χ² calculado pelo método descrito por Pavla⁵². Calcule o valor de χ² para cada combinação usando a seguinte fórmula.
O efeito de uma combinação foi definido como sinérgico quando o valor de χ² calculado foi maior que o valor tabelado para os graus de liberdade correspondentes (intervalo de confiança de 95%) e se a mortalidade observada excedeu a mortalidade esperada. Da mesma forma, se o valor de χ² calculado para qualquer combinação exceder o valor tabelado com alguns graus de liberdade, mas a mortalidade observada for menor que a mortalidade esperada, o tratamento é considerado antagônico. E se, em qualquer combinação, o valor de χ² calculado for menor que o valor tabelado nos graus de liberdade correspondentes, considera-se que a combinação não teve efeito.
Três a quatro combinações potencialmente sinérgicas (100 larvas e 50 adultos) foram selecionadas para testes contra um grande número de insetos. Os testes com adultos seguiram o procedimento descrito anteriormente. Além das misturas, os compostos individuais presentes nas misturas selecionadas também foram testados em números iguais de larvas e adultos de Aedes aegypti. A proporção da combinação é de uma parte da dose LC50 de um composto candidato para cada parte da dose LC50 do outro composto constituinte. No bioensaio de atividade em adultos, os compostos selecionados foram dissolvidos em acetona e aplicados em papel de filtro envolto em um recipiente cilíndrico de plástico de 1300 cm³. A acetona foi evaporada por 10 minutos e os adultos foram liberados. De forma semelhante, no bioensaio larvicida, as doses dos compostos candidatos com LC50 foram inicialmente dissolvidas em volumes iguais de DMSO e, em seguida, misturadas com 1 litro de água armazenada em recipientes de plástico de 1300 cm³, e as larvas foram liberadas.
Foi realizada uma análise probabilística de 71 dados de mortalidade registrados, utilizando os softwares SPSS (versão 16) e Minitab para calcular os valores de LC50.
Data da publicação: 01/07/2024