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A descoberta e o uso benéfico de produtos naturais podem ajudar a melhorar a vida humana.Os produtos químicos inibidores do crescimento das plantas são amplamente utilizados como herbicidas para controlar ervas daninhas.Devido à necessidade de utilização de diferentes tipos de herbicidas, surge a necessidade de identificar compostos com novos mecanismos de ação.Neste estudo, descobrimos um novo composto N-alcoxipirrol, coumamonamida, de Streptomyces werraensis MK493-CF1 e estabelecemos o processo completo de síntese.Através de ensaios de atividade biológica, descobrimos que o ácido urs-monoâmico é um intermediário sintético da urs-monoamida e um potencialinibidor de crescimento de plantas.Além disso, desenvolvemos vários derivados do ácido urbenônico, incluindo o derivado urbeniloxi (UDA), que possui alta atividade herbicida sem afetar negativamente o crescimento das células HeLa.Descobrimos também que os derivados do ácido urmotonico perturbam os microtúbulos das plantas;além disso, o KAND afeta os filamentos de actina e induz a morte celular;Esses efeitos multifacetados diferem daqueles dos inibidores de microtúbulos conhecidos e sugerem um novo mecanismo de ação para o ácido ursônico, o que representa uma vantagem importante no desenvolvimento de novos herbicidas.
A descoberta e aplicação prática de produtos naturais benéficos e seus derivados é um meio de melhorar a qualidade de vida humana.Os metabólitos secundários produzidos por microrganismos, plantas e insetos levaram a grandes avanços na medicina e na agricultura.Muitos antibióticos e medicamentos antileucêmicos foram desenvolvidos a partir de produtos naturais.Além disso, vários tipos depesticidas, fungicidas e herbicidas são extraídos desses produtos naturais para uso na agricultura.Em particular, os herbicidas para controlo de ervas daninhas são ferramentas importantes para aumentar o rendimento das colheitas na agricultura moderna, e vários tipos de compostos já são utilizados comercialmente.Vários processos celulares nas plantas, como fotossíntese, metabolismo de aminoácidos, síntese da parede celular, regulação da mitose, sinalização de fitohormônios ou síntese de proteínas, são considerados alvos típicos de herbicidas.Os compostos que inibem a função dos microtúbulos são uma classe comum de herbicidas que afetam o crescimento das plantas, afetando a regulação mitótica2.
Os microtúbulos são componentes do citoesqueleto e são amplamente conservados em células eucarióticas.O heterodímero de tubulina consiste em α-tubulina e β-tubulina formando protofilamentos de microtúbulos lineares, com 13 protofilamentos formando uma estrutura cilíndrica.Os microtúbulos desempenham múltiplas funções nas células vegetais, incluindo a determinação da forma celular, a divisão celular e o transporte intracelular .As células vegetais contêm microtúbulos abaixo da membrana plasmática interfásica, e acredita-se que esses chamados microtúbulos corticais controlem a organização das microfibrilas de celulose através da regulação dos complexos de celulose sintase .Os microtúbulos corticais das células epidérmicas da raiz, presentes na zona de rápido alongamento da ponta da raiz, estão localizados lateralmente, e as microfibras de celulose acompanham esses microtúbulos e limitam a direção da expansão celular, promovendo assim o alongamento anisotrópico das células.Portanto, a função dos microtúbulos está intimamente relacionada à morfologia da planta.As substituições de aminoácidos nos genes que codificam a tubulina causam distorção dos arranjos de microtúbulos corticais e crescimento do lado esquerdo ou direito em Arabidopsis 6,7.Da mesma forma, mutações em proteínas associadas aos microtúbulos que regulam a dinâmica dos microtúbulos também podem levar ao crescimento distorcido das raízes8,9,10,11,12,13.Além disso, o tratamento com herbicidas que perturbam os microtúbulos, como a disopiramida, também conhecida como pretilaclor, também causa crescimento oblíquo da raiz no lado esquerdo14.Estes dados indicam que a regulação precisa da função dos microtúbulos é crítica para determinar a direção do crescimento das plantas.
Vários tipos de inibidores de microtúbulos foram descobertos e esses medicamentos fizeram contribuições significativas para a pesquisa do citoesqueleto, bem como para a agricultura e a medicina2.Em particular, a orizalina, os compostos de dinitroanilina, a disopiramida, os compostos relacionados com a benzamida e os seus análogos podem inibir a função dos microtúbulos e, assim, inibir o crescimento das plantas.Portanto, eles são amplamente utilizados como herbicidas.No entanto, como os microtúbulos são um componente importante das células vegetais e animais, a maioria dos inibidores de microtúbulos são citotóxicos para ambos os tipos de células.Portanto, apesar da sua reconhecida utilidade como herbicidas, um número limitado de agentes antimicrotúbulos é utilizado para fins práticos.
Streptomyces é um gênero da família Streptomyces, que inclui bactérias aeróbias, gram-positivas e filamentosas e é amplamente conhecida por sua capacidade de produzir uma ampla gama de metabólitos secundários.Portanto, é considerada uma das mais importantes fontes de novos produtos naturais biologicamente ativos.No presente estudo, descobrimos um novo composto chamado coumamonamida, que foi isolado de Streptomyces werraensis MK493-CF1 e S. werraensis ISP 5486. Usando análise espectral e análise espectral completa, a estrutura da coumamonamida foi caracterizada e seu esqueleto único de N-alcoxipirrol foi determinado.síntese.Descobriu-se que o ácido ursmônico, um intermediário sintético da ursmonoamida e seus derivados, inibe o crescimento e a germinação da popular planta modelo Arabidopsis thaliana.Em um estudo de relação estrutura-atividade, descobrimos que um composto com C9 modificado em ácido ursônico, denominado derivado noniloxi do ácido ursônico (KAND), aumenta significativamente o efeito inibitório no crescimento e na germinação.Notavelmente, o inibidor de crescimento de plantas recentemente descoberto também afetou o crescimento do tabaco e da hepática e não foi citotóxico para bactérias ou células HeLa.Além disso, alguns derivados do ácido urmotonico induzem um fenótipo de raiz distorcido, implicando que estes derivados afetam direta ou indiretamente os microtúbulos.Consistente com esta ideia, as nossas observações de microtúbulos marcados imuno-histoquimicamente ou com proteínas fluorescentes indicam que o tratamento KAND despolimeriza os microtúbulos.Além disso, o tratamento com derivados do ácido kumamotonico rompeu os microfilamentos de actina.Assim, descobrimos um novo inibidor do crescimento vegetal cujo mecanismo de ação único envolve a destruição do citoesqueleto.
A cepa MK493-CF1 foi isolada do solo em Shinagawa-ku, Tóquio.A cepa MK493-CF1 formou micélio estromal bem ramificado.A sequência parcial do gene do RNA ribossômico 16S (1422 pb) foi determinada.Esta cepa é muito semelhante a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: cepa típica, 99,93%).Com base neste resultado, determinou-se que esta estirpe estava intimamente relacionada com a estirpe tipo de S. werraensis.Portanto, nomeamos provisoriamente esta cepa de S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T também produz os mesmos compostos bioativos.Como havia poucas pesquisas iniciais sobre a obtenção de produtos naturais a partir desse microrganismo, foram realizadas mais pesquisas químicas.Após cultivo de S. werraensis MK493-CF1 em meio de cevada por fermentação em estado sólido a 30°C durante 14 dias, o meio foi extraído com 50% de EtOH.Secaram-se 60 ml de amostra para obter 59,5 mg de extrato bruto.O extrato bruto foi submetido a HPLC de fase reversa para gerar N-metoxi-1H-pirrole-2-carboxamida (1, denominada coumamonamida, 36,0 mg).A quantidade total de 1 é aproximadamente 60% do extrato bruto.Portanto, decidimos estudar detalhadamente as propriedades da kumamotoamida 1.
A coumamonamida 1 é um pó branco amorfo e a espectrometria de massa de alta resolução (HRESIMS) confirma C6H8N2O2 (Fig. 1).O fragmento de pirrol substituído em C2 deste composto é caracterizado por δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH no espectro de RMN de 1H: 4,5 Hz , H-5) e δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), e o espectro de RMN de 13C mostra a presença de quatro átomos de carbono sp2.A presença de um grupo amida na posição C2 foi avaliada pela correlação HMBC do próton C-3 ao carbono amida carbonil em δC 161,1.Além disso, os picos de RMN de 1H e 13C em δH 4,10 (3H, S) e δC 68,3 indicam a presença de grupos N-metoxi na molécula.Embora a posição correta do grupo metoxi ainda não tenha sido determinada usando análise espectroscópica, como espectroscopia de diferença aprimorada e abreviatura nuclear de Overhauser (NOEDF), a N-metoxi-1H-pirrole-2-carboxamida tornou-se o primeiro composto candidato.
Para determinar a estrutura correta de 1, foi realizada uma síntese total (Fig. 2a).O tratamento da 2-aminopiridina 2 comercialmente disponível com m-CPBA resultou no N-óxido 3 correspondente com rendimento quantitativo.Após a 2-aminoazidação de 2, a reação de ciclocondensação descrita por Abramovich foi realizada em benzeno a 90°C para obter a 1-hidroxi-1H-pirrol-2-carbonitrila desejada 5 em gramas.Velocidade 60% (dois estágios).15,16.A metilação e a hidrólise de 4 deram então ácido 1-metoxi-1H-pirrol-2-carboxílico (denominado “ácido cumotônico”, 6) com bom rendimento (70%, duas etapas).Finalmente, a amidação via cloreto de ácido intermediário 6 usando amônia aquosa deu a amida 1 de Kumamoto com rendimento de 98%.Todos os dados espectrais do 1 sintetizado foram semelhantes aos do 1 isolado, então a estrutura de 1 foi determinada;
Síntese geral e análise da atividade biológica da urbenamida e do ácido urbênico.(a) Síntese total de amida Kumamoto.(b) Mudas de Arabidopsis Columbia (Col) de tipo selvagem com sete dias de idade foram cultivadas em placas Murashige e Skoog (MS) contendo coumamonamida 6 ou coumamonamida 1 nas concentrações indicadas.Barra de escala = 1 cm.
Primeiro, avaliamos as atividades biológicas da urbenamida e seus intermediários quanto à sua capacidade de modular o crescimento das plantas.Adicionamos várias concentrações de ursmonamida 1 ou ácido ursmônico 6 ao meio ágar MS e cultivamos mudas de Arabidopsis thaliana neste meio.Estes ensaios mostraram que altas concentrações (500 μM) de 6 inibiram o crescimento das raízes (Fig. 2b).Em seguida, geramos vários derivados substituindo a posição N1 de 6 e realizamos estudos de relação estrutura-atividade sobre eles (o processo de síntese análoga é descrito nas Informações de Apoio (SI)).Mudas de Arabidopsis foram cultivadas em meio contendo 50 μM de derivados de ácido ursônico e o comprimento da raiz foi medido.como mostrado na imagem.Conforme mostrado nas Figuras 3a, b e S1, os ácidos cumamo têm diferentes comprimentos de cadeias alcóxi lineares (9, 10, 11, 12 e 13) ou cadeias alcóxi grandes (15, 16 e 17) na posição N1.Os derivados apresentaram inibição significativa do crescimento radicular.Além disso, descobrimos que a aplicação de 200 μM 10, 11 ou 17 inibiu a germinação (Figs. 3c e S2).
Estudo da relação estrutura-atividade da amida de Kumamoto e compostos relacionados.(a) Estrutura e esquema de síntese de análogos.(b) Quantificação do comprimento da raiz de mudas com 7 dias de idade cultivadas em meio MS com ou sem 50 μM de derivados de coumamonamida.Os asteriscos indicam diferenças significativas com o tratamento simulado (teste t, p<0,05).n>18. Os dados são apresentados como média ± DP.nt significa “não testado” porque mais de 50% das sementes não germinaram.(c) Quantificação da taxa de germinação de sementes tratadas incubadas por 7 dias em meio MS com ou sem 200 μM de coumamonamida e compostos relacionados.Os asteriscos indicam diferenças significativas com o tratamento simulado (teste do qui-quadrado).n=96.
Curiosamente, a adição de cadeias laterais de alquilo mais longas que C9 reduziu a actividade inibitória, sugerindo que os compostos relacionados com o ácido kumamotoico requerem cadeias laterais de um certo tamanho para exibir a sua actividade biológica.
Como a análise da relação estrutura-atividade mostrou que C9 foi modificado para ácido ursônico e o derivado noniloxi do ácido ursônico (doravante denominado KAND 11) foi o inibidor de crescimento vegetal mais eficaz, conduzimos uma caracterização mais detalhada de KAND 11. Tratamento de Arabidopsis com 50 μM de KAND 11 preveniu quase completamente a germinação, enquanto concentrações mais baixas (40, 30, 20 ou 10 μM) de KAND 11 inibiram o crescimento das raízes de maneira dependente da dose (Fig. 4a, b).Para testar se o KAND 11 afeta a viabilidade do meristema radicular, examinamos os meristemas radiculares corados com iodeto de propídio (PI) e medimos o tamanho da área do meristema.O tamanho do meristema de mudas cultivadas em meio contendo 25 μM KAND-11 foi de 151,1 ± 32,5 μm, enquanto o tamanho do meristema de mudas cultivadas em meio controle contendo DMSO foi de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d) , o que indica que o KAND-11 restaura a atividade celular.espalhando.Meristema de raiz.Consistente com isso, o tratamento com KAND 11 reduziu a quantidade do marcador de divisão celular CDKB2;1p::CDKB2;sinal 1-GUS no meristema da raiz (Fig. 4e) 17 .Estes resultados indicam que o KAND 11 inibe o crescimento das raízes, reduzindo a atividade de proliferação celular.
Análise do efeito inibitório dos derivados do ácido urbenônico (derivados urbeniloxi) no crescimento.(a) Mudas de Col de tipo selvagem com 7 dias de idade cultivadas em placas MS com as concentrações indicadas de KAND 11. Barra de escala = 1 cm.(b) Quantificação do comprimento da raiz.As letras indicam diferenças significativas (teste Tukey HSD, p<0,05).n>16. Os dados são apresentados como média ± DP.(c) Microscopia confocal de raízes Col de tipo selvagem coradas com iodeto de propídio cultivadas em placas MS com ou sem 25 μM KAND 11. Colchetes brancos indicam meristema de raiz.Barra de escala = 100 μm.(d) Quantificação do tamanho do meristema radicular (n = 10 a 11).As diferenças estatísticas foram determinadas usando o teste t (p<0,05).As barras representam o tamanho médio do meristema.(e) Microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) de um meristema de raiz contendo a construção CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS corado e corado em plântulas com 5 dias de idade cultivadas em placas MS com ou sem ensaio KAND 25 µM.
A fitotoxicidade do KAND 11 foi ainda testada usando outra planta dicotiledônea, o tabaco (Nicotiana tabacum), e um importante organismo modelo de planta terrestre, a hepática (Marchantia polymorpha).Tal como no caso de Arabidopsis, as plântulas de tabaco SR-1 cultivadas em meio contendo 25 μM de KAND 11 produziram raízes mais curtas (Fig. 5a).Além disso, 40 das 48 sementes germinaram em placas contendo 200 μM de KAND 11, enquanto todas as 48 sementes germinaram em meio tratado de forma simulada, indicando que concentrações mais altas de KAND foram significativas (p< 0,05;teste qui-quadrado) inibiu a germinação do tabaco.(Fig. 5b).Além disso, a concentração de KAND 11 que inibiu o crescimento bacteriano na hepática foi semelhante à concentração eficaz em Arabidopsis (Fig. 5c).Estes resultados indicam que o KAND 11 pode inibir o crescimento de uma variedade de plantas.Em seguida, investigamos a possível citotoxicidade de compostos relacionados à monoamida de urso em outros organismos, nomeadamente células HeLa humanas e cepa DH5α de Escherichia coli, como representantes de células animais e bacterianas superiores, respectivamente.Em uma série de ensaios de proliferação celular, observamos que a coumamonamida 1, o ácido coumamonamídico 6 e o KAND 11 não afetaram o crescimento de células HeLa ou E. coli em concentrações de 100 μM (Fig. 5d, e).
Inibição do crescimento de KAND 11 em organismos não-Arabidopsis.(a) Mudas de tabaco SR-1 de tipo selvagem com duas semanas de idade foram cultivadas em placas MS posicionadas verticalmente contendo 25 μM KAND 11. (b) Mudas de tabaco SR-1 de tipo selvagem com duas semanas de idade foram cultivadas em placas posicionadas horizontalmente. Placas MS contendo 200 μM KAND 11. ( c) Botões de hepática Tak-1 de tipo selvagem com duas semanas de idade cultivados em placas Gamborg B5 com as concentrações indicadas de KAND 11. Setas vermelhas indicam esporos que pararam de crescer nas duas semanas de incubação período.(d) Ensaio de proliferação celular de células HeLa.O número de células viáveis foi medido em intervalos de tempo fixos utilizando um kit de contagem de células 8 (Dojindo).Como controle, as células HeLa foram tratadas com 5 μg/ml de actinomicina D (Act D), que inibe a transcrição da RNA polimerase e causa a morte celular.As análises foram realizadas em triplicata.(e) Ensaio de proliferação celular de E. coli.O crescimento de E. coli foi analisado medindo OD600.Como controle, as células foram tratadas com 50 μg/ml de ampicilina (Amp), que inibe a síntese da parede celular bacteriana.As análises foram realizadas em triplicata.
Para decifrar o mecanismo de ação da citotoxicidade causada por compostos relacionados à uramida, reanalisamos derivados do ácido urbênico com efeitos inibitórios moderados.como mostrado na imagem.Conforme mostrado nas Figuras 2b, 6a, mudas cultivadas em placas de ágar contendo altas concentrações (200 μM) de ácido urmotonico 6 produziram raízes mais curtas e curvadas à esquerda (θ = - 23,7 ± 6,1), enquanto que de mudas cultivadas no meio controle, o as mudas produziram raízes quase retas (θ = – 3,8 ± 7,1).Sabe-se que esse crescimento oblíquo característico resulta da disfunção dos microtúbulos corticais14,18.Consistente com esse achado, as drogas desestabilizadoras de microtúbulos, disopiramida e orizalina, induziram inclinação semelhante da raiz sob nossas condições de crescimento (Figs. 2b, 6a).Ao mesmo tempo, testamos derivados do ácido urmotonico e selecionamos vários deles que, em determinadas concentrações, induziam o crescimento oblíquo das raízes.Os compostos 8, 9 e 15 mudaram a direção do crescimento da raiz em 75 μM, 50 μM e 40 μM, respectivamente, indicando que estes compostos podem efetivamente desestabilizar os microtúbulos (Fig. 2b, 6a).Também testamos o derivado de ácido ursólico mais potente, KAND 11, em uma concentração mais baixa (15 µM) e descobrimos que a aplicação de KAND 11 inibiu o crescimento radicular e que a direção do crescimento radicular era irregular, embora tendessem a inclinar-se para a esquerda ( Figura C3)..Como concentrações mais altas de drogas desestabilizadoras de microtúbulos às vezes inibem o crescimento das plantas em vez de causar inclinação das raízes, avaliamos posteriormente a possibilidade de que o KAND 11 afete os microtúbulos, observando microtúbulos corticais nas células epidérmicas das raízes.A imunohistoquímica utilizando anticorpos anti-β-tubulina em células epidérmicas de raízes de plântulas tratadas com 25 μM KAND 11 mostrou o desaparecimento de quase todos os microtúbulos corticais em células epidérmicas na zona de alongamento (Fig. 6b).Estes resultados indicam que o ácido kumamotonico e os seus derivados actuam directa ou indirectamente nos microtúbulos para os romper e que estes compostos são novos inibidores de microtúbulos.
O ácido ursônico e seus derivados alteram os microtúbulos corticais em Arabidopsis thaliana.(a) Ângulo de inclinação da raiz medido na presença de vários derivados do ácido urmotonico nas concentrações indicadas.Os efeitos de dois compostos conhecidos por inibir os microtúbulos: disopiramida e orizalina também foram analisados.A inserção mostra o padrão usado para medir o ângulo de crescimento da raiz.Os asteriscos indicam diferenças significativas com o tratamento simulado (teste t, p<0,05).n>19. Barra de escala = 1 cm.(b) Microtúbulos corticais em células epidérmicas na zona de alongamento.Microtúbulos em raízes de Arabidopsis Col de tipo selvagem cultivadas em placas MS com ou sem 25 μM KAND 11 foram visualizados por coloração imuno-histoquímica usando anticorpos primários de β-tubulina e anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor.Barra de escala = 10 μm.(c) Estrutura mitótica dos microtúbulos no meristema da raiz.Os microtúbulos foram visualizados por meio de coloração imuno-histoquímica.Estruturas mitóticas, incluindo zonas prófase, fusos e fragmoplastos, foram contadas a partir de imagens confocal.As setas indicam estruturas de microtúbulos mitóticos.Os asteriscos indicam diferenças significativas com o tratamento simulado (teste t, p<0,05).n>9. Barra de escala = 50 µm.
Embora Ursa tenha a capacidade de interromper a função dos microtúbulos, espera-se que seu mecanismo de ação seja diferente dos agentes despolimerizantes típicos de microtúbulos.Por exemplo, concentrações mais elevadas de agentes despolimerizantes de microtúbulos, como disopiramida e orizalina, induzem a expansão anisotrópica das células epidérmicas, enquanto o KAND 11 não o faz.Além disso, a co-aplicação de KAND 11 e disopiramida resultou numa resposta combinada de crescimento radicular induzida por disopiramida e foi observada inibição do crescimento induzida por KAND 11 (Fig. S4).Também analisamos a resposta do mutante disopiramida 1-1 (phs1-1) hipersensível ao KAND 11. phs1-1 tem uma mutação pontual não canônica da tubulina quinase e produz raízes mais curtas quando tratado com disopiramida9,20.Mudas mutantes phs1-1 cultivadas em meio ágar contendo KAND 11 tiveram raízes mais curtas semelhantes àquelas cultivadas em disopirâmide (fig. S5).
Além disso, observamos estruturas de microtúbulos mitóticos, como zonas prófase, fusos e fragmoplastos, no meristema radicular de plântulas tratadas com KAND 11. Consistente com as observações para CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, uma diminuição significativa em o número de microtúbulos mitóticos foi observado (Fig. .6c).
Para caracterizar a citotoxicidade do KAND 11 na resolução subcelular, tratamos células em suspensão BY-2 do tabaco com KAND 11 e observamos a sua resposta.Primeiro adicionamos KAND 11 às células BY-2 que expressam TagRFP-TUA6, que marca fluorescentemente os microtúbulos, para avaliar o efeito do KAND 11 nos microtúbulos corticais.A densidade dos microtúbulos corticais foi avaliada por meio de análise de imagens, que quantificou a porcentagem de pixels do citoesqueleto entre os pixels citoplasmáticos.Os resultados do ensaio mostraram que após o tratamento com 50 μM ou 100 μM KAND 11 por 1 hora, a densidade diminuiu significativamente para 0,94 ± 0,74% ou 0,23 ± 0,28%, respectivamente, enquanto a densidade das células tratadas com DMSO foi de 1,61 ± 0,34. % (Fig. 7a).Estes resultados são consistentes com a observação em Arabidopsis de que o tratamento com KAND 11 induz a despolimerização dos microtúbulos corticais (Fig. 6b).Também examinamos a linha BY-2 com filamentos de actina marcados com GFP-ABD após tratamento com a mesma concentração de KAND 11 e observamos que o tratamento com KAND 11 rompeu os filamentos de actina.O tratamento com 50 μM ou 100 μM KAND 11 por 1 h reduziu significativamente a densidade do filamento de actina para 1, 20 ± 0, 62% ou 0, 61 ± 0, 26%, respectivamente, enquanto a densidade nas células tratadas com DMSO foi de 1, 69 ± 0, 51% (Fig. 2).7b).Esses resultados contrastam com os efeitos da propizamida, que não afeta os filamentos de actina, e da latrunculina B, um despolimerizador de actina que não afeta os microtúbulos (SI Figura S6).Além disso, o tratamento com coumamonamida 1, ácido coumamonamida 6 ou KAND 11 não afetou os microtúbulos nas células HeLa (SI Figura S7).Assim, acredita-se que o mecanismo de ação do KAND 11 seja diferente daquele dos desreguladores do citoesqueleto conhecidos.Além disso, nossa observação microscópica de células BY-2 tratadas com KAND 11 revelou o início da morte celular durante o tratamento com KAND 11 e mostrou que a proporção de células mortas coradas com azul de Evans não aumentou significativamente após 30 min de tratamento com KAND 11, enquanto após 90 minutos de tratamento com 50 μM ou 100 μM KAND, o número de células mortas aumentou para 43, 7% ou 80, 1%, respectivamente (Fig. 7c).Tomados em conjunto, estes dados indicam que o novo derivado do ácido ursólico KAND 11 é um inibidor do citoesqueleto específico da planta com um mecanismo de ação anteriormente desconhecido.
KAND afeta microtúbulos corticais, filamentos de actina e viabilidade das células BY-2 do tabaco.(a) Visualização de microtúbulos corticais em células BY-2 na presença de TagRFP-TUA6.Células BY-2 tratadas com KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO foram examinadas por microscopia confocal.A densidade dos microtúbulos corticais foi calculada a partir de micrografias de 25 células independentes.As letras indicam diferenças significativas (teste Tukey HSD, p<0,05).Barra de escala = 10 μm.(b) Filamentos de actina corticais em células BY-2 visualizados na presença de GFP-ABD2.Células BY-2 tratadas com KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO foram examinadas por microscopia confocal.A densidade dos filamentos corticais de actina foi calculada a partir de micrografias de 25 células independentes.As letras indicam diferenças significativas (teste Tukey HSD, p<0,05).Barra de escala = 10 μm.(c) Observação de células BY-2 mortas por coloração com azul de Evans.Células BY-2 tratadas com KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO foram examinadas por microscopia de campo claro.n=3.Barra de escala = 100 μm.
A descoberta e aplicação de novos produtos naturais levaram a avanços significativos em vários aspectos da vida humana, incluindo a medicina e a agricultura.Pesquisas históricas foram realizadas para obter compostos úteis a partir de recursos naturais.Em particular, os actinomicetos são conhecidos por serem úteis como antibióticos antiparasitários para nematóides devido à sua capacidade de produzir vários metabólitos secundários, como a avermectina, o principal composto da ivermectina e da bleomicina e seus derivados, utilizados medicinalmente como agente anticancerígeno21,22.Da mesma forma, uma variedade de compostos herbicidas foram descobertos a partir de actinomicetos, alguns dos quais já são utilizados comercialmente 1,23.Portanto, a análise de metabólitos de actinomicetos para isolar produtos naturais com atividades biológicas desejadas é considerada uma estratégia eficaz.Neste estudo, descobrimos um novo composto, a coumamonamida, de S. werraensis e o sintetizamos com sucesso.O ácido ursônico é um intermediário sintético da urbenamida e seus derivados.Pode causar o enrolamento característico das raízes, exibir atividade herbicida moderada a forte e danificar direta ou indiretamente os microtúbulos das plantas.No entanto, o mecanismo de ação do ácido urmotonico pode diferir daquele dos inibidores de microtúbulos existentes, uma vez que o KAND 11 também rompe os filamentos de actina e causa a morte celular, sugerindo um mecanismo regulador pelo qual o ácido urmotonico e seus derivados influenciam uma ampla gama de estruturas do citoesqueleto..
Uma caracterização mais detalhada do ácido urbenônico ajudará a compreender melhor o mecanismo de ação do ácido urbenônico.Em particular, o próximo objetivo é avaliar a capacidade do ácido ursônico de se ligar aos microtúbulos reduzidos para determinar se o ácido ursônico e seus derivados atuam diretamente nos microtúbulos e os despolimerizam, ou se sua ação resulta na desestabilização dos microtúbulos.Além disso, no caso em que os microtúbulos não são um alvo direto, a identificação do local de ação e dos alvos moleculares do ácido ursônico nas células vegetais ajudará a compreender melhor as propriedades dos compostos relacionados e possíveis formas de melhorar a atividade herbicida.Nosso ensaio de bioatividade revelou a capacidade citotóxica única do ácido ursônico no crescimento de plantas como Arabidopsis thaliana, tabaco e hepática, enquanto nem E. coli nem células HeLa foram afetadas.Pouca ou nenhuma toxicidade para células animais é uma vantagem dos derivados do ácido ursônico se forem desenvolvidos como herbicidas para uso em campos agrícolas abertos.Na verdade, uma vez que os microtúbulos são estruturas comuns em eucariotas, a sua inibição seletiva nas plantas é um requisito fundamental para os herbicidas.Por exemplo, a propizamida, um agente despolimerizante de microtúbulos que se liga diretamente à tubulina e inibe a polimerização, é utilizada como herbicida devido à sua baixa toxicidade para células animais24.Em contraste com a disopiramida, as benzamidas relacionadas têm diferentes especificidades de alvo.Além dos microtúbulos vegetais, o RH-4032 ou a benzoxamida também inibem os microtúbulos de células animais ou oomicetos, respectivamente, e a zalilamida é utilizada como fungicida devido à sua baixa fitotoxicidade25,26,27.O urso recém-descoberto e seus derivados exibem citotoxicidade seletiva contra plantas, mas vale a pena notar que modificações adicionais podem alterar a especificidade do seu alvo, fornecendo potencialmente derivados adicionais para o controle de fungos patogênicos ou oomicetos.
As propriedades únicas do ácido urbenônico e seus derivados são úteis para seu desenvolvimento como herbicidas e uso como ferramentas de pesquisa.A importância do citoesqueleto no controle da forma das células vegetais é amplamente reconhecida.Estudos anteriores mostraram que as plantas desenvolveram mecanismos complexos de organização dos microtúbulos corticais, controlando a dinâmica dos microtúbulos para controlar adequadamente a morfogênese.Um grande número de moléculas responsáveis pela regulação da atividade dos microtúbulos foi identificado e pesquisas relacionadas ainda estão em andamento3,4,28.Nossa compreensão atual da dinâmica dos microtúbulos nas células vegetais não explica completamente os mecanismos de organização dos microtúbulos corticais.Por exemplo, embora tanto a disopiramida quanto a orizalina possam despolimerizar os microtúbulos, a disopiramida causa distorção grave da raiz, enquanto a orizalina tem um efeito relativamente suave.Além disso, mutações na tubulina, que estabiliza os microtúbulos, também causam dextrorotação nas raízes, enquanto o paclitaxel, que também estabiliza a dinâmica dos microtúbulos, não o faz.Portanto, estudar e identificar os alvos moleculares do ácido ursólico deverá fornecer novos insights sobre a regulação dos microtúbulos corticais das plantas.Da mesma forma, futuras comparações de produtos químicos que são eficazes na promoção do crescimento distorcido, como a disopiramida, e de produtos químicos menos eficazes, como a orizalina ou o ácido kumamotor, fornecerão pistas sobre como ocorre o crescimento distorcido.
Por outro lado, os rearranjos do citoesqueleto relacionados à defesa são outra possibilidade para explicar a citotoxicidade do ácido ursônico.A infecção de um patógeno ou a introdução de um elicitor nas células vegetais às vezes causa destruição do citoesqueleto e subsequente morte celular29.Por exemplo, foi relatado que a criptoxantina derivada do oomiceto rompe os microtúbulos e os filamentos de actina antes da morte das células do tabaco, semelhante ao que ocorre com o tratamento com KAND30,31.As semelhanças entre as respostas de defesa e as respostas celulares induzidas pelo ácido ursônico nos levaram a levantar a hipótese de que elas desencadeiam processos celulares comuns, embora seja evidente um efeito mais rápido e mais forte do ácido ursônico do que da criptoxantina.No entanto, estudos demonstraram que a ruptura dos filamentos de actina promove a morte celular espontânea, que nem sempre é acompanhada pela ruptura dos microtúbulos29.Além disso, resta saber se o patógeno ou o elicitor causa o crescimento distorcido da raiz, como fazem os derivados do ácido ursônico.Assim, o conhecimento molecular que liga as respostas de defesa e o citoesqueleto é um problema atraente a ser abordado.Ao explorar a presença de compostos de baixo peso molecular relacionados com o ácido ursónico, bem como uma gama de derivados com potências variadas, podem proporcionar oportunidades para atingir mecanismos celulares desconhecidos.
Em conjunto, a descoberta e aplicação de novos compostos que modulam a dinâmica dos microtúbulos fornecerão métodos poderosos para abordar os complexos mecanismos moleculares subjacentes à determinação da forma das células vegetais.Neste contexto, o composto ácido urmotonico recentemente desenvolvido, que afecta os microtúbulos e os filamentos de actina e induz a morte celular, pode proporcionar uma oportunidade para decifrar a ligação entre o controlo dos microtúbulos e estes outros mecanismos.Assim, análises químicas e biológicas utilizando ácido urbenônico nos ajudarão a compreender os mecanismos reguladores moleculares que controlam o citoesqueleto vegetal.
Inocular S. werraensis MK493-CF1 em um frasco Erlenmeyer de 500 mL contendo 110 mL de meio de semente consistindo em 2% (p/v) de galactose, 2% (p/v) de pasta de essência, 1% (p/v) de composição de Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (p/v) de extrato de milho (KOGOSTCH Co., Ltd., Japão), 0,2% (p/v) (NH4)2SO4 e 0,2% de CaCO3 em água deionizada.(pH 7,4 antes da esterilização).As culturas de sementes foram incubadas num agitador rotativo (180 rpm) a 27°C durante 2 dias.Cultivo de produção via fermentação em estado sólido.A cultura de sementes (7 ml) foi transferida para um frasco K-1 de 500 ml contendo 40 g de meio de produção consistindo em 15 g de cevada prensada (MUSO Co., Ltd., Japão) e 25 g de água deionizada (pH não ajustado antes da esterilização).).A fermentação ocorreu a 30°C no escuro durante 14 dias.O material de fermentação foi extraído com 40 ml/garrafa de EtOH e centrifugado (1500 g, 4°C, 10 min).O sobrenadante da cultura (60 ml) foi extraído com uma mistura de 10% de MeOH/EtOAc.A camada orgânica foi evaporada sob pressão reduzida para obter um resíduo (59,5 mg), que foi submetido a HPLC com eluição gradiente (0-10 minutos: 90%) em uma coluna de fase reversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × comprimento 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutos: 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35–45 minutos: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutos: 90% H2O /EtOH a 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155-200 min: 100% EtOH) a uma taxa de fluxo de 1,5 ml/min, a coumamonamida (1, 36,0 mg) foi isolada como um pó amorfo branco.
Kumamotoamida(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor calculado: 141,0659, valor medido: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
As sementes de Columbia (Col-0) foram obtidas do Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) com permissão para uso em pesquisa.As sementes Col-0 foram propagadas e mantidas em nossas condições de laboratório e usadas como plantas de Arabidopsis do tipo selvagem.As sementes de Arabidopsis foram esterilizadas na superfície e cultivadas em meio Murashige e Skoog de meia concentração contendo 2% de sacarose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (p/v) de ácido 2-(4-morfolino)etanossulfônico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ).) e ágar 1,5% (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C e luz constante.As sementes do mutante phs1-1 foram fornecidas por T. Hashimoto (Instituto Nara de Ciência e Tecnologia).
Sementes da cepa SR-1 foram fornecidas por T. Hashimoto (Instituto Nara de Ciência e Tecnologia) e usadas como plantas de tabaco de tipo selvagem.As sementes de tabaco foram esterilizadas na superfície e embebidas em água estéril por três noites para promover a germinação, depois colocadas em uma solução com metade da concentração contendo 2% de sacarose, 0,05% (p/v) de MES e 0,8% de goma gelana (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.e meio Skoog) com pH 5,7 e incubados a 23°C sob luz constante.
A cepa Tak-1 foi fornecida por T. Kohchi (Universidade de Kyoto) e foi usada como unidade experimental padrão para o estudo da hepática.Gemma foi obtida de plantas cultivadas esterilizadas e depois plaqueada em meio Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) contendo 1% de sacarose e 0,3% de goma gelana e incubada a 23°C sob luz contínua.
Células de tabaco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) foram fornecidas por S. Hasezawa (Universidade de Tóquio).As células BY-2 foram diluídas 95 vezes em meio Linsmeier e Skoog modificado e suplementadas semanalmente com ácido 2,4-diclorofenoxiacético 32 .A suspensão celular foi misturada num agitador rotativo a 130 rpm a 27°C no escuro.Lavar as células com 10 vezes o volume de meio fresco e ressuspender no mesmo meio.Linhas celulares transgênicas BY-2 que expressam estavelmente o marcador de microtúbulos TagRFP-TUA6 ou o marcador de filamento de actina GFP-ABD2 sob o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor foram geradas como descrito .Estas linhas celulares podem ser mantidas e sincronizadas utilizando procedimentos semelhantes aos utilizados para a linha celular BY-2 original.
As células HeLa foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1,2 U/ml de penicilina e 1,2 μg/ml de estreptomicina numa incubadora a 37°C com 5% de CO2.
Todos os experimentos descritos neste manuscrito foram realizados de acordo com os regulamentos e diretrizes japonesas de biossegurança.
Os compostos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) como soluções estoque e diluídos em meio MS para Arabidopsis e tabaco ou meio Gamborg B5 para hepática.Para o ensaio de inibição do crescimento radicular, mais de 10 sementes por placa foram semeadas em meio ágar contendo os compostos indicados ou DMSO.As sementes foram incubadas em câmara de crescimento por 7 dias.As mudas foram fotografadas e o comprimento das raízes medido.Para o ensaio de germinação de Arabidopsis, 48 sementes por placa foram semeadas em meio ágar contendo 200 μM de composto ou DMSO.Sementes de Arabidopsis foram cultivadas em câmara de crescimento e o número de plântulas germinadas foi contado 7 dias após a germinação (dag).Para o ensaio de germinação do tabaco, 24 sementes por placa foram semeadas em meio ágar contendo 200 μM de KAND ou DMSO.As sementes de tabaco foram cultivadas em câmara de crescimento e o número de plântulas germinadas foi contado após 14 dias.Para o ensaio de inibição do crescimento da hepática, 9 embriões de cada placa foram plaqueados em meio ágar contendo as concentrações indicadas de KAND ou DMSO e incubados numa câmara de crescimento durante 14 dias.
Use mudas coradas com 5 mg/ml de iodeto de propídio (PI) para visualizar a organização do meristema radicular.Os sinais PI foram observados por microscopia de fluorescência utilizando um microscópio confocal de varredura a laser TCS SPE (Leica Microsystems).
A coloração histoquímica das raízes com β-glucuronidase (GUS) foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Malami e Benfey36.As plântulas foram fixadas em acetona a 90% durante a noite, coradas com ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucurônico 0,5 mg/ml em tampão GUS por 1 hora e colocadas em solução hidratada de cloraldeído.(8 g de hidrato de cloral, 2 ml de água e 1 ml de glicerol) e observado por microscopia de contraste de interferência diferencial utilizando um microscópio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Os ângulos das raízes foram medidos em mudas com 7 dias de idade cultivadas em placas colocadas verticalmente.Meça o ângulo da raiz em relação à direção do vetor de gravidade conforme descrito na etapa 6.
A disposição dos microtúbulos corticais foi observada conforme descrito, com pequenas modificações no protocolo 37 .Anticorpo anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) e IgG anti-camundongo conjugado com Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) foram utilizados como anticorpos primários e secundários nas diluições 1:1000 e 1:100, respectivamente.As imagens de fluorescência foram adquiridas utilizando um microscópio confocal de varredura a laser TCS SPE (Leica Microsystems).Adquira imagens Z-stack e crie projeções de intensidade máxima de acordo com as instruções do fabricante.
O ensaio de proliferação de células HeLa foi realizado utilizando o Cell Counting Kit 8 (Dojindo) de acordo com as instruções do fabricante.
O crescimento de E. coli DH5α foi analisado medindo a densidade celular em cultura utilizando um espectrofotômetro a 600 nm (OD600).
A organização do citoesqueleto em células transgênicas BY-2 foi observada usando um microscópio de fluorescência equipado com um dispositivo de varredura confocal CSU-X1 (Yokogawa) e uma câmera sCMOS (Zyla, Andor Technology).A densidade do citoesqueleto foi avaliada por análise de imagens, que quantificou a porcentagem de pixels do citoesqueleto entre os pixels citoplasmáticos em imagens confocal usando o software ImageJ conforme descrito38,39.
Para detectar a morte celular em células BY-2, uma alíquota da suspensão celular foi incubada com azul de Evans a 0,05% durante 10 minutos à temperatura ambiente.A coloração seletiva com azul de Evans de células mortas depende da extrusão do corante de células viáveis pela membrana plasmática intacta .As células coradas foram observadas utilizando um microscópio de campo claro (BX53, Olympus).
As células HeLa foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS numa incubadora humidificada a 37°C e 5% de CO2.As células foram tratadas com 100 μM de KAND 11, ácido kumamonâmico 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml de colcemid (Gibco) ou 100 ng/ml de Nocodmaze (Sigma) durante 6 h a 37°C.As células foram fixadas com MetOH durante 10 min e depois com acetato durante 5 min à temperatura ambiente.As células fixas foram incubadas com anticorpo primário de β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluído em 0,5% BSA/PBS durante 2 horas, lavadas 3 vezes com TBST e depois incubadas com anticorpo de cabra Alexa Fluor.488 1 hora.– IgG de rato (Thermo Fisher Scientific: A11001) e 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) diluído em 0,5% BSA/PBS.Após lavagem com TBST três vezes, as células coradas foram observadas num microscópio invertido Nikon Eclipse Ti-E.As imagens foram capturadas com uma câmera CCD Hamamatsu ORCA-R2 resfriada usando o software MetaMorph (Molecular Devices).
Horário da postagem: 17 de junho de 2024