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A descoberta e o uso benéfico de produtos naturais podem contribuir para a melhoria da vida humana. Substâncias químicas inibidoras do crescimento vegetal são amplamente utilizadas como herbicidas para o controle de ervas daninhas. Devido à necessidade de se utilizar diferentes tipos de herbicidas, há uma demanda crescente pela identificação de compostos com novos mecanismos de ação. Neste estudo, descobrimos um novo composto N-alcoxipirrólico, a coumamonamida, a partir de Streptomyces werraensis MK493-CF1 e estabelecemos o processo de síntese completo. Através de ensaios de atividade biológica, descobrimos que o ácido urs-monoâmico é um intermediário sintético da urs-monoamida e um potencial agente redutor.inibidor de crescimento vegetalAlém disso, desenvolvemos vários derivados do ácido urbenônico, incluindo o derivado urbeniloxilado (UDA), que apresenta alta atividade herbicida sem afetar negativamente o crescimento de células HeLa. Também descobrimos que os derivados do ácido ursônico desestabilizam os microtúbulos vegetais; além disso, o KAND afeta os filamentos de actina e induz a morte celular. Esses efeitos multifacetados diferem daqueles dos inibidores de microtúbulos conhecidos e sugerem um novo mecanismo de ação para o ácido ursônico, o que representa uma importante vantagem no desenvolvimento de novos herbicidas.
A descoberta e a aplicação prática de produtos naturais benéficos e seus derivados são um meio de melhorar a qualidade de vida humana. Os metabólitos secundários produzidos por microrganismos, plantas e insetos têm levado a grandes avanços na medicina e na agricultura. Muitos antibióticos e medicamentos antileucêmicos foram desenvolvidos a partir de produtos naturais. Além disso, vários tipos depesticidasFungicidas e herbicidas são extraídos desses produtos naturais para uso na agricultura. Em particular, herbicidas para controle de ervas daninhas são ferramentas importantes para aumentar a produtividade agrícola na agricultura moderna, e vários tipos de compostos já são usados comercialmente. Diversos processos celulares em plantas, como fotossíntese, metabolismo de aminoácidos, síntese da parede celular, regulação da mitose, sinalização de fitormônios ou síntese de proteínas, são considerados alvos típicos de herbicidas. Compostos que inibem a função dos microtúbulos são uma classe comum de herbicidas que afetam o crescimento das plantas ao influenciar a regulação mitótica.
Os microtúbulos são componentes do citoesqueleto e são amplamente conservados em células eucarióticas. O heterodímero de tubulina consiste em α-tubulina e β-tubulina formando protofilamentos de microtúbulos lineares, com 13 protofilamentos formando uma estrutura cilíndrica. Os microtúbulos desempenham múltiplas funções em células vegetais, incluindo a determinação da forma celular, divisão celular e transporte intracelular3,4. As células vegetais contêm microtúbulos abaixo da membrana plasmática interfásica, e acredita-se que esses chamados microtúbulos corticais controlem a organização das microfibrilas de celulose por meio da regulação dos complexos da celulose sintase4,5. Os microtúbulos corticais das células epidérmicas da raiz, presentes na zona de rápido alongamento da ponta da raiz, estão localizados lateralmente, e as microfibras de celulose seguem esses microtúbulos e limitam a direção da expansão celular, promovendo assim o alongamento celular anisotrópico. Portanto, a função dos microtúbulos está intimamente relacionada à morfologia vegetal. Substituições de aminoácidos em genes que codificam a tubulina causam distorção nos arranjos de microtúbulos corticais e crescimento para a esquerda ou para a direita em Arabidopsis 6,7. Da mesma forma, mutações em proteínas associadas a microtúbulos que regulam a dinâmica dos microtúbulos também podem levar ao crescimento radicular distorcido8,9,10,11,12,13. Além disso, o tratamento com herbicidas que desestabilizam os microtúbulos, como a disopiramida, também conhecida como pretilacloro, também causa crescimento radicular oblíquo para a esquerda14. Esses dados indicam que a regulação precisa da função dos microtúbulos é crucial para determinar a direção do crescimento da planta.
Diversos tipos de inibidores de microtúbulos foram descobertos, e esses fármacos têm contribuído significativamente para a pesquisa do citoesqueleto, bem como para a agricultura e a medicina². Em particular, a orizalina, os compostos de dinitroanilina, a disopiramida, os compostos relacionados à benzamida e seus análogos podem inibir a função dos microtúbulos e, consequentemente, o crescimento das plantas. Portanto, são amplamente utilizados como herbicidas. Contudo, como os microtúbulos são um componente importante das células vegetais e animais, a maioria dos inibidores de microtúbulos é citotóxica para ambos os tipos celulares. Assim, apesar de sua reconhecida utilidade como herbicidas, um número limitado de agentes antimicrotúbulos é utilizado para fins práticos.
Streptomyces é um gênero da família Streptomyces, que inclui bactérias filamentosas, gram-positivas e aeróbicas, amplamente conhecidas por sua capacidade de produzir uma ampla gama de metabólitos secundários. Portanto, é considerado uma das fontes mais importantes de novos produtos naturais biologicamente ativos. No presente estudo, descobrimos um novo composto chamado coumamonamida, isolado de Streptomyces werraensis MK493-CF1 e S. werraensis ISP 5486. Utilizando análise espectral e análise espectral completa, a estrutura da coumamonamida foi caracterizada e seu esqueleto único de N-alcoxipirrol foi determinado. O ácido ursmônico, um intermediário sintético da ursmonoamida e seus derivados, demonstrou inibir o crescimento e a germinação da planta modelo Arabidopsis thaliana. Em um estudo de relação estrutura-atividade, descobrimos que um composto com a modificação em C9 para ácido ursônico, denominado derivado noniloxi do ácido ursônico (KAND), aumenta significativamente o efeito inibitório sobre o crescimento e a germinação. Notavelmente, o inibidor de crescimento vegetal recém-descoberto também afetou o crescimento do tabaco e da hepática, e não foi citotóxico para bactérias ou células HeLa. Além disso, alguns derivados do ácido urmotônico induzem um fenótipo radicular distorcido, o que implica que esses derivados afetam os microtúbulos direta ou indiretamente. Em consonância com essa ideia, nossas observações de microtúbulos marcados por imuno-histoquímica ou com proteínas fluorescentes indicam que o tratamento com KAND despolimeriza os microtúbulos. Ademais, o tratamento com derivados do ácido kumamatônico interrompeu os microfilamentos de actina. Assim, descobrimos um novo inibidor de crescimento vegetal cujo mecanismo de ação singular envolve a destruição do citoesqueleto.
A cepa MK493-CF1 foi isolada do solo em Shinagawa-ku, Tóquio. A cepa MK493-CF1 formou micélio estromal bem ramificado. A sequência parcial do gene do RNA ribossômico 16S (1422 pb) foi determinada. Esta cepa é muito semelhante a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: cepa típica, 99,93%). Com base neste resultado, determinou-se que esta cepa era intimamente relacionada à cepa tipo de S. werraensis. Portanto, denominamos provisoriamente esta cepa de S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T também produz os mesmos compostos bioativos. Como havia pouca pesquisa inicial sobre a obtenção de produtos naturais deste microrganismo, pesquisas químicas adicionais foram realizadas. Após o cultivo de S. werraensis MK493-CF1 em meio de cevada por fermentação em estado sólido a 30 °C durante 14 dias, o meio foi extraído com EtOH a 50%. Sessenta mililitros da amostra foram secos, obtendo-se 59,5 mg de extrato bruto. O extrato bruto foi submetido à cromatografia líquida de fase reversa (HPLC) para obtenção de N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida (1, denominada coumamonamida, 36,0 mg). A quantidade total de 1 corresponde a aproximadamente 60% do extrato bruto. Portanto, decidimos estudar em detalhes as propriedades da coumamonamida 1.
A cumamonamida 1 é um pó amorfo branco e a espectrometria de massa de alta resolução (HRESIMS) confirma a estrutura C6H8N2O2 (Fig. 1). O fragmento pirrólico substituído na posição C2 deste composto é caracterizado por δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH no espectro de RMN de 1H: 4,5 Hz, H-5) e δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), e o espectro de RMN de 13C mostra a presença de quatro átomos de carbono sp2. A presença de um grupo amida na posição C2 foi confirmada pela correlação HMBC do próton C-3 com o carbono carbonílico da amida em δC 161,1. Além disso, os picos de RMN de ¹H e ¹³C em δH 4,10 (3H, S) e δC 68,3 indicam a presença de grupos N-metoxi na molécula. Embora a posição correta do grupo metoxi ainda não tenha sido determinada por meio de análises espectroscópicas, como espectroscopia de diferença aprimorada e campo de força atômica nuclear (NOEDF), a N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida tornou-se o primeiro composto candidato.
Para determinar a estrutura correta de 1, foi realizada uma síntese total (Fig. 2a). O tratamento da 2-aminopiridina 2, disponível comercialmente, com m-CPBA resultou no N-óxido 3 correspondente com rendimento quantitativo. Após a 2-aminoazidação de 2, a reação de ciclocondensação descrita por Abramovich foi realizada em benzeno a 90 °C para obter o 1-hidroxi-1H-pirrol-2-carbonitrila 5 desejado em gramas. Velocidade de 60% (duas etapas). 15,16. A metilação e hidrólise de 4 forneceram então o ácido 1-metoxi-1H-pirrol-2-carboxílico (denominado “ácido cumotônico”, 6) com bom rendimento (70%, duas etapas). Finalmente, a amidação via intermediário cloreto de ácido 6 usando amônia aquosa forneceu a amida de Kumamoto 1 com rendimento de 98%. Todos os dados espectrais de 1 sintetizado foram semelhantes aos de 1 isolado, portanto, a estrutura de 1 foi determinada;
Síntese geral e análise da atividade biológica da urbenamida e do ácido urbênico. (a) Síntese total da amida de Kumamoto. (b) Plântulas de Arabidopsis Columbia (Col) do tipo selvagem com sete dias de idade foram cultivadas em placas de Murashige e Skoog (MS) contendo cumamonamida 6 ou cumamonamida 1 nas concentrações indicadas. Barra de escala = 1 cm.
Primeiramente, avaliamos as atividades biológicas da urbenamida e seus intermediários quanto à sua capacidade de modular o crescimento vegetal. Adicionamos diversas concentrações de ursmonamida 1 ou ácido ursônico 6 ao meio de ágar MS e cultivamos plântulas de Arabidopsis thaliana nesse meio. Esses ensaios mostraram que altas concentrações (500 μM) de 6 inibiram o crescimento radicular (Fig. 2b). Em seguida, geramos diversos derivados pela substituição da posição N1 de 6 e realizamos estudos de relação estrutura-atividade com eles (o processo de síntese dos análogos é descrito nas Informações Suplementares). Plântulas de Arabidopsis foram cultivadas em um meio contendo 50 μM de derivados de ácido ursônico, e o comprimento da raiz foi medido, conforme mostrado na figura. Como mostrado nas Figuras 3a, b e S1, os ácidos cumamo apresentam diferentes comprimentos de cadeias alcóxi lineares (9, 10, 11, 12 e 13) ou cadeias alcóxi longas (15, 16 e 17) na posição N1. Os derivados mostraram inibição significativa do crescimento radicular. Além disso, observamos que a aplicação de 200 μM de 10, 11 ou 17 inibiu a germinação (Figs. 3c e S2).
Estudo da relação estrutura-atividade da amida de Kumamoto e compostos relacionados. (a) Estrutura e esquema de síntese de análogos. (b) Quantificação do comprimento da raiz de plântulas de 7 dias cultivadas em meio MS com ou sem 50 μM de derivados de cumamonamida. Os asteriscos indicam diferenças significativas em relação ao tratamento controle (teste t, p < 0,05).< 0,05). n>18. Os dados são apresentados como média ± DP. nt significa “não testado”, pois mais de 50% das sementes não germinaram. (c) Quantificação da taxa de germinação de sementes tratadas e incubadas por 7 dias em meio MS com ou sem 200 μM de cumamonamida e compostos relacionados. Os asteriscos indicam diferenças significativas em relação ao tratamento controle (teste do qui-quadrado). n=96.
Curiosamente, a adição de cadeias laterais alquílicas maiores que C9 reduziu a atividade inibitória, sugerindo que os compostos relacionados ao ácido kumamatoico requerem cadeias laterais de um determinado tamanho para exibirem sua atividade biológica.
Como a análise da relação estrutura-atividade mostrou que o C9 foi modificado para ácido ursônico e que o derivado noniloxilado do ácido ursônico (doravante denominado KAND 11) foi o inibidor de crescimento vegetal mais eficaz, realizamos uma caracterização mais detalhada do KAND 11. O tratamento de Arabidopsis com 50 μM de KAND 11 impediu quase completamente a germinação, enquanto concentrações mais baixas (40, 30, 20 ou 10 μM) de KAND 11 inibiram o crescimento radicular de forma dose-dependente (Fig. 4a, b). Para testar se o KAND 11 afeta a viabilidade do meristema radicular, examinamos meristemas radiculares corados com iodeto de propídio (PI) e medimos a área do meristema. O tamanho do meristema de plântulas cultivadas em meio contendo 25 μM de KAND-11 foi de 151,1 ± 32,5 μm, enquanto o tamanho do meristema de plântulas cultivadas em meio controle contendo DMSO foi de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), o que indica que o KAND-11 restaura a atividade celular. Em consonância com isso, o tratamento com KAND-11 reduziu a quantidade do marcador de divisão celular CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS no meristema radicular (Fig. 4e)17. Esses resultados indicam que o KAND-11 inibe o crescimento radicular reduzindo a atividade de proliferação celular.
Análise do efeito inibitório de derivados do ácido urbenônico (derivados urbeniloxi) no crescimento. (a) Plântulas de Col do tipo selvagem com 7 dias de idade, cultivadas em placas de MS com as concentrações indicadas de KAND 11. Barra de escala = 1 cm. (b) Quantificação do comprimento da raiz. Letras indicam diferenças significativas (teste de Tukey HSD, p < 0,05).< 0,05). n>16. Os dados são apresentados como média ± DP. (c) Microscopia confocal de raízes de Col do tipo selvagem coradas com iodeto de propídio, cultivadas em placas MS com ou sem 25 μM de KAND 11. Os colchetes brancos indicam o meristema radicular. Barra de escala = 100 µm. (d) Quantificação do tamanho do meristema radicular (n = 10 a 11). As diferenças estatísticas foram determinadas usando o teste t (p < 0,05).< 0,05). As barras representam o tamanho médio do meristema. (e) Microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) de um meristema radicular contendo a construção CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS corado e corado em plântulas de 5 dias cultivadas em placas MS com ou sem ensaio KAND de 25 µM.
A fitotoxicidade do KAND 11 foi posteriormente testada utilizando outra planta dicotiledônea, o tabaco (Nicotiana tabacum), e um importante organismo modelo de planta terrestre, a hepática (Marchantia polymorpha). Assim como no caso da Arabidopsis, as plântulas de tabaco SR-1 cultivadas em meio contendo 25 μM de KAND 11 produziram raízes mais curtas (Fig. 5a). Além disso, 40 das 48 sementes germinaram em placas contendo 200 μM de KAND 11, enquanto todas as 48 sementes germinaram em meios tratados com placebo, indicando que concentrações mais elevadas de KAND foram significativas (p < 0,05).< 0,05; teste qui-quadrado) inibiu a germinação do tabaco (Fig. 5b). Além disso, a concentração de KAND 11 que inibiu o crescimento bacteriano em hepática foi semelhante à concentração efetiva em Arabidopsis (Fig. 5c). Esses resultados indicam que KAND 11 pode inibir o crescimento de uma variedade de plantas. Em seguida, investigamos a possível citotoxicidade de compostos relacionados à monoamida em outros organismos, nomeadamente células HeLa humanas e a cepa DH5α de Escherichia coli, como representantes de células animais superiores e bacterianas, respectivamente. Em uma série de ensaios de proliferação celular, observamos que a cumamonamida 1, o ácido cumamonamídico 6 e o KAND 11 não afetaram o crescimento de células HeLa ou E. coli em concentrações de 100 μM (Fig. 5d,e).
Inibição do crescimento de KAND 11 em organismos não-Arabidopsis. (a) Plântulas de tabaco SR-1 selvagem com duas semanas de idade foram cultivadas em placas de MS posicionadas verticalmente contendo 25 μM de KAND 11. (b) Plântulas de tabaco SR-1 selvagem com duas semanas de idade foram cultivadas em placas de MS posicionadas horizontalmente contendo 200 μM de KAND 11. (c) Brotos de hepática Tak-1 selvagem com duas semanas de idade cultivados em placas Gamborg B5 com as concentrações indicadas de KAND 11. As setas vermelhas indicam esporos que pararam de crescer durante o período de incubação de duas semanas. (d) Ensaio de proliferação celular de células HeLa. O número de células viáveis foi medido em intervalos de tempo fixos usando um kit de contagem de células 8 (Dojindo). Como controle, as células HeLa foram tratadas com 5 μg/ml de actinomicina D (Act D), que inibe a transcrição da RNA polimerase e causa morte celular. As análises foram realizadas em triplicata. (e) Ensaio de proliferação celular de E. coli. O crescimento de E. coli foi analisado pela medição da absorbância a 600 nm (DO600). Como controle, as células foram tratadas com 50 μg/ml de ampicilina (Amp), que inibe a síntese da parede celular bacteriana. As análises foram realizadas em triplicata.
Para decifrar o mecanismo de ação da citotoxicidade causada por compostos relacionados à uramida, reanalisamos derivados do ácido urbênico com efeitos inibitórios moderados, como mostrado na figura. Conforme ilustrado nas Figuras 2b e 6a, plântulas cultivadas em placas de ágar contendo altas concentrações (200 μM) de ácido urmotônico 6 produziram raízes mais curtas e curvadas para a esquerda (θ = – 23,7 ± 6,1), enquanto que as plântulas cultivadas no meio controle produziram raízes quase retas (θ = – 3,8 ± 7,1). Sabe-se que esse crescimento oblíquo característico resulta da disfunção dos microtúbulos corticais14,18. Em consonância com essa descoberta, os fármacos desestabilizadores de microtúbulos disopiramida e orizalina induziram inclinação radicular semelhante em nossas condições de crescimento (Figuras 2b e 6a). Simultaneamente, testamos derivados do ácido urmotônico e selecionamos alguns que, em determinadas concentrações, induziram crescimento radicular oblíquo. Os compostos 8, 9 e 15 alteraram a direção do crescimento radicular em concentrações de 75 μM, 50 μM e 40 μM, respectivamente, indicando que esses compostos podem desestabilizar os microtúbulos de forma eficaz (Fig. 2b, 6a). Também testamos o derivado de ácido ursólico mais potente, KAND 11, em uma concentração menor (15 µM) e observamos que a aplicação de KAND 11 inibiu o crescimento radicular e que a direção do crescimento radicular foi irregular, embora as raízes tendessem a inclinar-se para a esquerda (Figura C3). Como concentrações mais elevadas de fármacos desestabilizadores de microtúbulos às vezes inibem o crescimento da planta em vez de causar inclinação radicular, avaliamos posteriormente a possibilidade de KAND 11 afetar os microtúbulos, observando os microtúbulos corticais nas células epidérmicas da raiz. A imuno-histoquímica utilizando anticorpos anti-β-tubulina em células epidérmicas de raízes de plântulas tratadas com 25 μM de KAND 11 mostrou o desaparecimento de quase todos os microtúbulos corticais nas células epidérmicas da zona de alongamento (Fig. 6b). Esses resultados indicam que o ácido kumamatônico e seus derivados atuam direta ou indiretamente sobre os microtúbulos, desestabilizando-os, e que esses compostos são novos inibidores de microtúbulos.
O ácido ursônico e seus derivados alteram os microtúbulos corticais em Arabidopsis thaliana. (a) Ângulo de inclinação da raiz medido na presença de vários derivados do ácido ursônico nas concentrações indicadas. Os efeitos de dois compostos conhecidos por inibir os microtúbulos: disopiramida e orizalina também foram analisados. A figura inserida mostra o padrão usado para medir o ângulo de crescimento da raiz. Os asteriscos indicam diferenças significativas em relação ao tratamento controle (teste t, p < 0,05).< 0,05). n>19. Barra de escala = 1 cm. (b) Microtúbulos corticais em células epidérmicas na zona de alongamento. Microtúbulos em raízes de Arabidopsis Col do tipo selvagem cultivadas em placas MS com ou sem 25 μM de KAND 11 foram visualizados por coloração imuno-histoquímica usando anticorpos primários anti-β-tubulina e anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor. Barra de escala = 10 µm. (c) Estrutura mitótica de microtúbulos no meristema radicular. Os microtúbulos foram visualizados por coloração imuno-histoquímica. Estruturas mitóticas, incluindo zonas de prófase, fusos e fragmoplastos, foram contadas a partir de imagens de microscopia confocal. As setas indicam estruturas de microtúbulos mitóticos. Os asteriscos indicam diferenças significativas em relação ao tratamento controle (teste t, p < 0,05).< 0,05). n>9. Barra de escala = 50 µm.
Embora a Ursa tenha a capacidade de interromper a função dos microtúbulos, espera-se que seu mecanismo de ação seja diferente dos agentes despolimerizantes de microtúbulos típicos. Por exemplo, concentrações mais altas de agentes despolimerizantes de microtúbulos, como disopiramida e orizalina, induzem a expansão anisotrópica das células epidérmicas, enquanto o KAND 11 não. Além disso, a aplicação conjunta de KAND 11 e disopiramida resultou em uma resposta combinada de crescimento radicular induzida por disopiramida e inibição do crescimento induzida por KAND 11 (Fig. S4). Também analisamos a resposta do mutante hipersensível à disopiramida 1-1 (phs1-1) ao KAND 11. O phs1-1 apresenta uma mutação pontual não canônica na quinase da tubulina e produz raízes mais curtas quando tratado com disopiramida9,20. Plântulas mutantes phs1-1 cultivadas em meio de ágar contendo KAND 11 apresentaram raízes mais curtas, semelhantes às cultivadas em disopiramida (Fig. S5).
Além disso, observamos estruturas de microtúbulos mitóticos, como zonas de prófase, fusos e fragmoplastos, no meristema radicular de plântulas tratadas com KAND 11. De forma consistente com as observações para CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, observou-se uma diminuição significativa no número de microtúbulos mitóticos (Fig. 6c).
Para caracterizar a citotoxicidade do KAND 11 em resolução subcelular, tratamos células em suspensão BY-2 de tabaco com KAND 11 e observamos sua resposta. Inicialmente, adicionamos KAND 11 a células BY-2 expressando TagRFP-TUA6, que marca fluorescentemente os microtúbulos, para avaliar o efeito do KAND 11 nos microtúbulos corticais. A densidade dos microtúbulos corticais foi avaliada por meio de análise de imagem, que quantificou a porcentagem de pixels do citoesqueleto entre os pixels citoplasmáticos. Os resultados do ensaio mostraram que, após o tratamento com 50 μM ou 100 μM de KAND 11 por 1 hora, a densidade diminuiu significativamente para 0,94 ± 0,74% ou 0,23 ± 0,28%, respectivamente, enquanto a densidade das células tratadas com DMSO foi de 1,61 ± 0,34% (Fig. 7a). Esses resultados são consistentes com a observação em Arabidopsis de que o tratamento com KAND 11 induz a despolimerização dos microtúbulos corticais (Fig. 6b). Também examinamos a linhagem BY-2 com filamentos de actina marcados com GFP-ABD após tratamento com a mesma concentração de KAND 11 e observamos que o tratamento com KAND 11 interrompeu os filamentos de actina. O tratamento com 50 μM ou 100 μM de KAND 11 por 1 h reduziu significativamente a densidade dos filamentos de actina para 1,20 ± 0,62% ou 0,61 ± 0,26%, respectivamente, enquanto a densidade em células tratadas com DMSO foi de 1,69 ± 0,51% (Fig. 2b). Esses resultados contrastam com os efeitos da propizamida, que não afeta os filamentos de actina, e da latrunculina B, um despolimerizador de actina que não afeta os microtúbulos (Figura S6 do SI). Além disso, o tratamento com cumamonamida 1, ácido cumamonamida 6 ou KAND 11 não afetou os microtúbulos em células HeLa (Figura S7 do SI). Assim, acredita-se que o mecanismo de ação do KAND 11 seja diferente do de disruptores do citoesqueleto conhecidos. Ademais, nossa observação microscópica de células BY-2 tratadas com KAND 11 revelou o início da morte celular durante o tratamento com KAND 11 e mostrou que a proporção de células mortas coradas com azul de Evans não aumentou significativamente após 30 minutos de tratamento com KAND 11, enquanto que, após 90 minutos de tratamento com 50 μM ou 100 μM de KAND, o número de células mortas aumentou para 43,7% ou 80,1%, respectivamente (Fig. 7c). Em conjunto, esses dados indicam que o novo derivado do ácido ursólico, KAND 11, é um inibidor do citoesqueleto específico de plantas com um mecanismo de ação até então desconhecido.
KAND afeta os microtúbulos corticais, os filamentos de actina e a viabilidade das células BY-2 de tabaco. (a) Visualização dos microtúbulos corticais em células BY-2 na presença de TagRFP-TUA6. Células BY-2 tratadas com KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO foram examinadas por microscopia confocal. A densidade dos microtúbulos corticais foi calculada a partir de micrografias de 25 células independentes. As letras indicam diferenças significativas (teste de Tukey HSD, p < 0,05).< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (b) Filamentos de actina cortical em células BY-2 visualizados na presença de GFP-ABD2. Células BY-2 tratadas com KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO foram examinadas por microscopia confocal. A densidade dos filamentos de actina cortical foi calculada a partir de micrografias de 25 células independentes. Letras indicam diferenças significativas (teste de Tukey HSD, p < 0,05).< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (c) Observação de células BY-2 mortas por coloração com azul de Evans. Células BY-2 tratadas com KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO foram examinadas por microscopia de campo claro. n=3. Barra de escala = 100 µm.
A descoberta e a aplicação de novos produtos naturais têm levado a avanços significativos em vários aspectos da vida humana, incluindo a medicina e a agricultura. Historicamente, pesquisas têm sido realizadas para obter compostos úteis a partir de recursos naturais. Em particular, sabe-se que os actinomicetos são úteis como antibióticos antiparasitários para nematoides devido à sua capacidade de produzir vários metabólitos secundários, como a avermectina, o composto principal da ivermectina e da bleomicina e seus derivados, usados medicinalmente como agentes anticancerígenos21,22. Da mesma forma, uma variedade de compostos herbicidas foi descoberta em actinomicetos, alguns dos quais já são usados comercialmente1,23. Portanto, a análise de metabólitos de actinomicetos para isolar produtos naturais com as atividades biológicas desejadas é considerada uma estratégia eficaz. Neste estudo, descobrimos um novo composto, a cumamonamida, em S. werraensis e o sintetizamos com sucesso. O ácido ursônico é um intermediário sintético da urbenamida e seus derivados. Pode causar o enrolamento característico das raízes, apresentar atividade herbicida de moderada a forte e danificar direta ou indiretamente os microtúbulos das plantas. No entanto, o mecanismo de ação do ácido urmotônico pode diferir do de inibidores de microtúbulos existentes, uma vez que o KAND 11 também interrompe os filamentos de actina e causa morte celular, sugerindo um mecanismo regulatório pelo qual o ácido urmotônico e seus derivados influenciam uma ampla gama de estruturas do citoesqueleto.
Uma caracterização mais detalhada do ácido ursônico ajudará a compreender melhor seu mecanismo de ação. Em particular, o próximo objetivo é avaliar a capacidade do ácido ursônico de se ligar a microtúbulos reduzidos para determinar se o ácido ursônico e seus derivados atuam diretamente sobre os microtúbulos, despolimerizando-os, ou se sua ação resulta na desestabilização dos microtúbulos. Além disso, caso os microtúbulos não sejam um alvo direto, a identificação do sítio de ação e dos alvos moleculares do ácido ursônico em células vegetais contribuirá para uma melhor compreensão das propriedades de compostos relacionados e possíveis maneiras de aprimorar sua atividade herbicida. Nosso ensaio de bioatividade revelou a capacidade citotóxica singular do ácido ursônico no crescimento de plantas como Arabidopsis thaliana, tabaco e hepáticas, enquanto células de E. coli e HeLa não foram afetadas. A baixa ou nenhuma toxicidade para células animais é uma vantagem dos derivados do ácido ursônico, caso sejam desenvolvidos como herbicidas para uso em campos agrícolas abertos. De fato, como os microtúbulos são estruturas comuns em eucariotos, sua inibição seletiva em plantas é um requisito fundamental para herbicidas. Por exemplo, a propizamida, um agente despolimerizante de microtúbulos que se liga diretamente à tubulina e inibe a polimerização, é usada como herbicida devido à sua baixa toxicidade para células animais24. Em contraste com a disopiramida, as benzamidas relacionadas apresentam especificidades de alvo diferentes. Além dos microtúbulos vegetais, o RH-4032 ou benzoxamida também inibe os microtúbulos de células animais ou oomicetos, respectivamente, e a zalilamida é usada como fungicida devido à sua baixa fitotoxicidade25,26,27. O composto recém-descoberto e seus derivados exibem citotoxicidade seletiva contra plantas, mas vale ressaltar que modificações adicionais podem alterar sua especificidade de alvo, potencialmente fornecendo derivados adicionais para o controle de fungos ou oomicetos patogênicos.
As propriedades únicas do ácido urbenônico e seus derivados são úteis para o desenvolvimento de herbicidas e para o uso como ferramentas de pesquisa. A importância do citoesqueleto no controle da forma das células vegetais é amplamente reconhecida. Estudos anteriores demonstraram que as plantas desenvolveram mecanismos complexos de organização dos microtúbulos corticais, controlando a dinâmica desses microtúbulos para regular adequadamente a morfogênese. Um grande número de moléculas responsáveis pela regulação da atividade dos microtúbulos já foi identificado, e pesquisas relacionadas ainda estão em andamento3,4,28. Nossa compreensão atual da dinâmica dos microtúbulos em células vegetais não explica completamente os mecanismos de organização dos microtúbulos corticais. Por exemplo, embora tanto a disopiramida quanto a orizalina possam despolimerizar os microtúbulos, a disopiramida causa distorção severa das raízes, enquanto a orizalina tem um efeito relativamente leve. Além disso, mutações na tubulina, que estabiliza os microtúbulos, também causam dextrorrotação nas raízes, enquanto o paclitaxel, que também estabiliza a dinâmica dos microtúbulos, não causa esse efeito. Portanto, o estudo e a identificação dos alvos moleculares do ácido ursólico devem fornecer novos conhecimentos sobre a regulação dos microtúbulos corticais das plantas. Da mesma forma, futuras comparações entre substâncias químicas eficazes na promoção do crescimento distorcido, como a disopiramida, e substâncias menos eficazes, como a orizalina ou o ácido kumamotorico, fornecerão pistas sobre como ocorre esse crescimento distorcido.
Por outro lado, rearranjos do citoesqueleto relacionados à defesa são outra possibilidade para explicar a citotoxicidade do ácido ursônico. A infecção por um patógeno ou a introdução de um elicitor em células vegetais às vezes causa a destruição do citoesqueleto e subsequente morte celular29. Por exemplo, foi relatado que a criptoxantina, derivada de oomicetos, interrompe microtúbulos e filamentos de actina antes da morte celular do tabaco, semelhante ao que ocorre com o tratamento com KAND30,31. As semelhanças entre as respostas de defesa e as respostas celulares induzidas pelo ácido ursônico nos levaram a hipotetizar que elas desencadeiam processos celulares comuns, embora um efeito mais rápido e forte do ácido ursônico do que da criptoxantina seja evidente. No entanto, estudos mostraram que a ruptura dos filamentos de actina promove a morte celular espontânea, que nem sempre é acompanhada pela ruptura dos microtúbulos29. Além disso, resta saber se o patógeno ou o elicitor causa crescimento radicular distorcido, como ocorre com os derivados do ácido ursônico. Assim, o conhecimento molecular que relaciona as respostas de defesa e o citoesqueleto é um problema interessante a ser abordado. Ao explorar a presença de compostos de baixo peso molecular relacionados ao ácido ursônico, bem como uma gama de derivados com potências variáveis, eles podem oferecer oportunidades para atingir mecanismos celulares desconhecidos.
Em conjunto, a descoberta e a aplicação de novos compostos que modulam a dinâmica dos microtúbulos fornecerão métodos poderosos para abordar os complexos mecanismos moleculares subjacentes à determinação da forma das células vegetais. Nesse contexto, o ácido urmotônico, um composto recentemente desenvolvido que afeta microtúbulos e filamentos de actina e induz a morte celular, pode oferecer uma oportunidade para decifrar a conexão entre o controle dos microtúbulos e esses outros mecanismos. Assim, análises químicas e biológicas utilizando o ácido urmotônico nos ajudarão a compreender os mecanismos regulatórios moleculares que controlam o citoesqueleto vegetal.
Inocule S. werraensis MK493-CF1 em um frasco Erlenmeyer de 500 mL com chicanas, contendo 110 mL de meio de cultura composto por 2% (p/v) de galactose, 2% (p/v) de pasta Essence, 1% (p/v) de Bacto composition - soja (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (p/v) de extrato de milho (KOGOSTCH Co., Ltd., Japão), 0,2% (p/v) de (NH4)2SO4 e 0,2% de CaCO3 em água deionizada (pH 7,4 antes da esterilização). As culturas iniciais foram incubadas em um agitador rotativo (180 rpm) a 27 °C por 2 dias. Cultivo para produção via fermentação em estado sólido. A cultura inicial (7 ml) foi transferida para um frasco K-1 de 500 ml contendo 40 g de meio de produção, composto por 15 g de cevada prensada (MUSO Co., Ltd., Japão) e 25 g de água deionizada (pH não ajustado antes da esterilização). A fermentação foi realizada a 30 °C no escuro por 14 dias. O material fermentado foi extraído com 40 ml/frasco de EtOH e centrifugado (1500 g, 4 °C, 10 min). O sobrenadante da cultura (60 ml) foi extraído com uma mistura de 10% de MeOH/EtOAc. A camada orgânica foi evaporada sob pressão reduzida para obter um resíduo (59,5 mg), que foi submetido a HPLC com eluição em gradiente (0–10 minutos: 90%) em uma coluna de fase reversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, DI 10 mm × comprimento 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutos: 90% H2O/CH3CN para 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35–45 minutos: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutos: 90% H2O/EtOH para 100% EtOH (gradiente), 155–200 min: 100% EtOH) a uma vazão de 1,5 ml/min, a cumamonamida (1, 36,0 mg) foi isolada como um pó amorfo branco.
Kumamotoamida(1); 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor calculado: 141,0659, valor medido: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Sementes de Arabidopsis da variedade Columbia (Col-0) foram obtidas do Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis (ABRC) com permissão para uso em pesquisa. As sementes Col-0 foram propagadas e mantidas em nossas condições de laboratório e utilizadas como plantas de Arabidopsis do tipo selvagem. As sementes de Arabidopsis foram esterilizadas superficialmente e cultivadas em meio Murashige e Skoog com metade da concentração original, contendo 2% de sacarose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (p/v) de ácido 2-(4-morfolino)etanossulfônico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) e 1,5% de ágar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C e luz constante. Sementes do mutante phs1-1 foram fornecidas por T. Hashimoto (Instituto de Ciência e Tecnologia de Nara).
Sementes da linhagem SR-1 foram fornecidas por T. Hashimoto (Instituto de Ciência e Tecnologia de Nara) e utilizadas como plantas de tabaco selvagem. As sementes de tabaco foram esterilizadas superficialmente e imersas em água estéril por três noites para promover a germinação, sendo então colocadas em uma solução com metade da concentração original contendo 2% de sacarose, 0,05% (p/v) de MES e 0,8% de goma gelana (Fujifilm Wako Pure Chemical) em meio de Murashige e Skoog com pH 5,7 e incubadas a 23°C sob luz constante.
A cepa Tak-1 foi fornecida por T. Kohchi (Universidade de Kyoto) e utilizada como unidade experimental padrão para o estudo de hepáticas. Gemma foi obtida a partir de plantas cultivadas esterilizadas e, em seguida, semeada em meio Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) contendo 1% de sacarose e 0,3% de goma gelana, sendo incubada a 23°C sob luz contínua.
As células BY-2 de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) foram fornecidas por S. Hasezawa (Universidade de Tóquio). As células BY-2 foram diluídas 95 vezes em meio Linsmeier e Skoog modificado e suplementadas semanalmente com ácido 2,4-diclorofenoxiacético 32. A suspensão celular foi homogeneizada em um agitador rotativo a 130 rpm a 27 °C no escuro. As células foram lavadas com 10 vezes o volume de meio fresco e ressuspensas no mesmo meio. Linhagens celulares transgênicas BY-2 expressando de forma estável o marcador de microtúbulos TagRFP-TUA6 ou o marcador de filamentos de actina GFP-ABD2 sob o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor foram geradas conforme descrito 33,34,35. Essas linhagens celulares podem ser mantidas e sincronizadas utilizando procedimentos semelhantes aos usados para a linhagem celular BY-2 original.
As células HeLa foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1,2 U/ml de penicilina e 1,2 μg/ml de estreptomicina em uma incubadora a 37°C com 5% de CO2.
Todos os experimentos descritos neste manuscrito foram realizados de acordo com as normas e diretrizes japonesas de biossegurança.
Os compostos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) como soluções estoque e diluídos em meio MS para Arabidopsis e tabaco ou em meio Gamborg B5 para hepáticas. Para o ensaio de inibição do crescimento radicular, mais de 10 sementes por placa foram semeadas em meio de ágar contendo os compostos indicados ou DMSO. As sementes foram incubadas em câmara de crescimento por 7 dias. As plântulas foram fotografadas e o comprimento das raízes foi medido. Para o ensaio de germinação de Arabidopsis, 48 sementes por placa foram semeadas em meio de ágar contendo 200 μM do composto ou DMSO. As sementes de Arabidopsis foram cultivadas em câmara de crescimento e o número de plântulas germinadas foi contado 7 dias após a germinação (dag). Para o ensaio de germinação de tabaco, 24 sementes por placa foram semeadas em meio de ágar contendo 200 μM de KAND ou DMSO. As sementes de tabaco foram cultivadas em câmara de crescimento e o número de plântulas germinadas foi contado após 14 dias. Para o ensaio de inibição do crescimento de hepáticas, 9 embriões de cada placa foram semeados em meio de ágar contendo as concentrações indicadas de KAND ou DMSO e incubados em câmara de crescimento por 14 dias.
Utilize plântulas coradas com iodeto de propídio (PI) a 5 mg/ml para visualizar a organização do meristema radicular. Os sinais de PI foram observados por microscopia de fluorescência utilizando um microscópio confocal de varredura a laser TCS SPE (Leica Microsystems).
A coloração histoquímica das raízes com β-glucuronidase (GUS) foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Malami e Benfey36. As plântulas foram fixadas em acetona a 90% durante a noite, coradas com 0,5 mg/ml de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurônico em tampão GUS por 1 hora e colocadas em uma solução hidratada de cloraldeído (8 g de hidrato de cloral, 2 ml de água e 1 ml de glicerol) e observadas por microscopia de contraste de interferência diferencial usando um microscópio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Os ângulos das raízes foram medidos em mudas de 7 dias cultivadas em placas posicionadas verticalmente. Meça o ângulo da raiz em relação à direção do vetor da gravidade, conforme descrito na etapa 6.
A disposição dos microtúbulos corticais foi observada conforme descrito, com pequenas modificações no protocolo 37. Anticorpos anti-β-tubulina (KMX-1, Merck Millipore: MAB3408) e IgG anti-camundongo conjugada com Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) foram utilizados como anticorpos primário e secundário, respectivamente, nas diluições de 1:1000 e 1:100. As imagens de fluorescência foram adquiridas utilizando um microscópio confocal de varredura a laser TCS SPE (Leica Microsystems). As imagens de pilha Z foram adquiridas e as projeções de intensidade máxima foram criadas de acordo com as instruções do fabricante.
O ensaio de proliferação de células HeLa foi realizado utilizando o kit de contagem celular 8 (Dojindo), seguindo as instruções do fabricante.
O crescimento da E. coli DH5α foi analisado medindo-se a densidade celular na cultura usando um espectrofotômetro a 600 nm (DO600).
A organização do citoesqueleto em células transgênicas BY-2 foi observada usando um microscópio de fluorescência equipado com um dispositivo de varredura confocal CSU-X1 (Yokogawa) e uma câmera sCMOS (Zyla, Andor Technology). A densidade do citoesqueleto foi avaliada por análise de imagem, que quantificou a porcentagem de pixels do citoesqueleto entre os pixels citoplasmáticos em imagens confocais usando o software ImageJ, conforme descrito38,39.
Para detectar a morte celular em células BY-2, uma alíquota da suspensão celular foi incubada com azul de Evans a 0,05% durante 10 minutos à temperatura ambiente. A coloração seletiva de células mortas pelo azul de Evans depende da extrusão do corante das células viáveis pela membrana plasmática intacta40. As células coradas foram observadas utilizando um microscópio de campo claro (BX53, Olympus).
As células HeLa foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2. As células foram tratadas com 100 μM de KAND 11, ácido kumamonâmico 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml de colcemida (Gibco) ou 100 ng/ml de Nocodmaze (Sigma) por 6 h a 37 °C. As células foram fixadas com MetOH por 10 min e, em seguida, com acetato por 5 min à temperatura ambiente. As células fixadas foram incubadas com anticorpo primário anti-β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluído em 0,5% de BSA/PBS por 2 horas, lavadas 3 vezes com TBST e, em seguida, incubadas com anticorpo secundário de cabra Alexa Fluor. – IgG de rato (Thermo Fisher Scientific: A11001) e 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluídos em 0,5% de BSA/PBS. Após três lavagens com TBST, as células coradas foram observadas em um microscópio invertido Nikon Eclipse Ti-E. As imagens foram capturadas com uma câmera CCD Hamamatsu ORCA-R2 refrigerada usando o software MetaMorph (Molecular Devices).
Data da publicação: 17 de junho de 2024