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A descoberta e o uso benéfico de produtos naturais podem contribuir para a melhoria da vida humana. Produtos químicos inibidores do crescimento de plantas são amplamente utilizados como herbicidas para o controle de plantas daninhas. Devido à necessidade de utilizar diferentes tipos de herbicidas, existe a necessidade de identificar compostos com novos mecanismos de ação. Neste estudo, descobrimos um novo composto N-alcoxipirrol, a coumamonamida, a partir de Streptomyces werraensis MK493-CF1 e estabelecemos o processo de síntese completo. Por meio de ensaios de atividade biológica, descobrimos que o ácido urs-monoâmico é um intermediário sintético da urs-monoamida e um potencialinibidor de crescimento de plantasAlém disso, desenvolvemos diversos derivados do ácido urbenônico, incluindo o derivado urbeniloxi (UDA), que apresenta alta atividade herbicida sem afetar negativamente o crescimento de células HeLa. Também constatamos que os derivados do ácido urbenônico rompem os microtúbulos das plantas; além disso, o KAND afeta os filamentos de actina e induz a morte celular; esses efeitos multifacetados diferem daqueles dos inibidores de microtúbulos conhecidos e sugerem um novo mecanismo de ação para o ácido ursônico, o que representa uma vantagem importante no desenvolvimento de novos herbicidas.
A descoberta e a aplicação prática de produtos naturais benéficos e seus derivados são um meio de melhorar a qualidade de vida humana. Metabólitos secundários produzidos por microrganismos, plantas e insetos levaram a grandes avanços na medicina e na agricultura. Muitos antibióticos e medicamentos antileucêmicos foram desenvolvidos a partir de produtos naturais. Além disso, vários tipos depesticidas, fungicidas e herbicidas são extraídos desses produtos naturais para uso na agricultura. Em particular, os herbicidas para controle de plantas daninhas são ferramentas importantes para aumentar a produtividade das culturas na agricultura moderna, e vários tipos de compostos já são utilizados comercialmente. Diversos processos celulares em plantas, como fotossíntese, metabolismo de aminoácidos, síntese da parede celular, regulação da mitose, sinalização de fitohormônios ou síntese de proteínas, são considerados alvos típicos de herbicidas. Compostos que inibem a função dos microtúbulos são uma classe comum de herbicidas que afetam o crescimento das plantas, afetando a regulação mitótica2.
Os microtúbulos são componentes do citoesqueleto e são amplamente conservados em células eucarióticas. O heterodímero da tubulina consiste em α-tubulina e β-tubulina formando protofilamentos de microtúbulos lineares, com 13 protofilamentos formando uma estrutura cilíndrica. Os microtúbulos desempenham múltiplas funções nas células vegetais, incluindo determinar a forma da célula, divisão celular e transporte intracelular3,4. As células vegetais contêm microtúbulos abaixo da membrana plasmática interfásica, e acredita-se que esses chamados microtúbulos corticais controlem a organização das microfibrilas de celulose por meio da regulação dos complexos de celulose sintase4,5. Os microtúbulos corticais das células epidérmicas da raiz, presentes na zona de rápido alongamento da ponta da raiz, estão localizados lateralmente, e as microfibras de celulose seguem esses microtúbulos e limitam a direção da expansão celular, promovendo assim o alongamento anisotrópico da célula. Portanto, a função dos microtúbulos está intimamente relacionada à morfologia da planta. Substituições de aminoácidos em genes que codificam a tubulina causam distorção nos arranjos de microtúbulos corticais e crescimento à esquerda ou à direita em Arabidopsis 6,7. Da mesma forma, mutações em proteínas associadas aos microtúbulos que regulam a dinâmica dos microtúbulos também podem levar a distorções no crescimento radicular 8,9,10,11,12,13. Além disso, o tratamento com herbicidas que desregulam os microtúbulos, como a disopiramida, também conhecida como pretilacloro, também causa crescimento radicular oblíquo à esquerda 14. Esses dados indicam que a regulação precisa da função dos microtúbulos é fundamental para determinar a direção do crescimento da planta.
Vários tipos de inibidores de microtúbulos foram descobertos, e esses fármacos têm feito contribuições significativas para a pesquisa do citoesqueleto, bem como para a agricultura e a medicina. Em particular, orizalina, compostos de dinitroanilina, disopiramida, compostos relacionados à benzamida e seus análogos podem inibir a função dos microtúbulos e, assim, inibir o crescimento das plantas. Portanto, são amplamente utilizados como herbicidas. No entanto, como os microtúbulos são um componente importante das células vegetais e animais, a maioria dos inibidores de microtúbulos é citotóxica para ambos os tipos celulares. Portanto, apesar de sua reconhecida utilidade como herbicidas, um número limitado de agentes antimicrotúbulos é utilizado para fins práticos.
Streptomyces é um gênero da família Streptomyces, que inclui bactérias aeróbicas, gram-positivas e filamentosas, sendo amplamente conhecido por sua capacidade de produzir uma ampla gama de metabólitos secundários. Portanto, é considerado uma das fontes mais importantes de novos produtos naturais biologicamente ativos. No estudo atual, descobrimos um novo composto chamado coumamonamida, que foi isolado de Streptomyces werraensis MK493-CF1 e S. werraensis ISP 5486. Usando análise espectral e análise espectral completa, a estrutura da coumamonamida foi caracterizada e seu esqueleto N-alcoxipirrol único foi determinado. Síntese. O ácido ursmônico, um intermediário sintético da ursmonoamida e seus derivados, inibiu o crescimento e a germinação da popular planta modelo Arabidopsis thaliana. Em um estudo de relação estrutura-atividade, descobrimos que um composto com C9 modificado para ácido ursônico, chamado derivado noniloxi do ácido ursônico (KAND), aumenta significativamente o efeito inibitório sobre o crescimento e a germinação. Notavelmente, o inibidor de crescimento vegetal recém-descoberto também afetou o crescimento do tabaco e da hepática e não foi citotóxico para bactérias ou células HeLa. Além disso, alguns derivados do ácido urmatônico induzem um fenótipo radicular distorcido, implicando que esses derivados afetam direta ou indiretamente os microtúbulos. Consistente com essa ideia, nossas observações de microtúbulos marcados imuno-histoquimicamente ou com proteínas fluorescentes indicam que o tratamento com KAND despolimeriza os microtúbulos. Além disso, o tratamento com derivados do ácido kumamatônico rompeu os microfilamentos de actina. Assim, descobrimos um novo inibidor de crescimento vegetal cujo mecanismo de ação exclusivo envolve a destruição do citoesqueleto.
A cepa MK493-CF1 foi isolada do solo em Shinagawa-ku, Tóquio. A cepa MK493-CF1 formou um micélio estromal bem ramificado. A sequência parcial do gene do RNA ribossômico 16S (1422 pb) foi determinada. Esta cepa é muito semelhante a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: cepa típica, 99,93%). Com base neste resultado, determinou-se que esta cepa estava intimamente relacionada à cepa tipo de S. werraensis. Portanto, nomeamos provisoriamente esta cepa S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T também produz os mesmos compostos bioativos. Como havia pouca pesquisa inicial sobre a obtenção de produtos naturais deste microrganismo, mais pesquisas químicas foram realizadas. Após o cultivo de S. werraensis MK493-CF1 em meio de cevada por fermentação em estado sólido a 30 °C por 14 dias, o meio foi extraído com 50% de EtOH. 60 ml da amostra foram secos para obter 59,5 mg de extrato bruto. O extrato bruto foi submetido à CLAE de fase reversa para gerar N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida (1, denominada coumamonamida, 36,0 mg). A quantidade total de 1 é de aproximadamente 60% do extrato bruto. Portanto, decidimos estudar em detalhes as propriedades da kumamotoamida 1.
A cumanamida 1 é um pó branco amorfo e a espectrometria de massas de alta resolução (HRESIMS) confirma C6H8N2O2 (Fig. 1). O fragmento pirrol substituído em C2 deste composto é caracterizado por δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH no espectro de RMN de 1H: 4,5 Hz, H-5) e δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), e o espectro de RMN de 13C mostra a presença de quatro átomos de carbono sp2. A presença de um grupo amida na posição C2 foi avaliada por correlação HMBC do próton C-3 com o carbono da carbonila da amida a δC 161,1. Além disso, picos de RMN de 1H e 13C em δH 4,10 (3H, S) e δC 68,3 indicam a presença de grupos N-metoxi na molécula. Embora a posição correta do grupo metoxi ainda não tenha sido determinada por meio de análises espectroscópicas, como espectroscopia de diferença aprimorada e abreviação nuclear de Overhauser (NOEDF), a N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida tornou-se o primeiro composto candidato.
Para determinar a estrutura correta de 1, foi realizada uma síntese completa (Fig. 2a). O tratamento da 2-aminopiridina 2 comercialmente disponível com m-CPBA resultou no N-óxido 3 correspondente com rendimento quantitativo. Após a 2-aminoazidação de 2, a reação de ciclocondensação descrita por Abramovich foi realizada em benzeno a 90 °C para obter a 1-hidroxi-1H-pirrol-2-carbonitrila 5 desejada em gramas. Velocidade 60% (duas etapas). 15,16. A metilação e a hidrólise de 4 deram então ácido 1-metoxi-1H-pirrol-2-carboxílico (denominado "ácido cumotônico", 6) com bom rendimento (70%, duas etapas). Finalmente, a amidação via intermediário de cloreto de ácido 6 usando amônia aquosa deu amida de Kumamoto 1 com rendimento de 98%. Todos os dados espectrais do 1 sintetizado foram semelhantes aos do 1 isolado, então a estrutura do 1 foi determinada;
Síntese geral e análise da atividade biológica da urbenamida e do ácido urbênico. (a) Síntese total de amida de Kumamoto. (b) Mudas selvagens de Arabidopsis Columbia (Col) com sete dias de idade foram cultivadas em placas de Murashige e Skoog (MS) contendo coumamonamida 6 ou coumamonamida 1 nas concentrações indicadas. Barra de escala = 1 cm.
Primeiramente, avaliamos as atividades biológicas da urbenamida e seus intermediários quanto à sua capacidade de modular o crescimento vegetal. Adicionamos várias concentrações de ursmonamida 1 ou ácido ursmônico 6 ao meio ágar MS e cultivamos mudas de Arabidopsis thaliana nesse meio. Esses ensaios mostraram que altas concentrações (500 μM) de 6 inibiram o crescimento radicular (Fig. 2b). Em seguida, geramos vários derivados substituindo a posição N1 de 6 e realizamos estudos de relação estrutura-atividade com eles (o processo de síntese de análogos é descrito nas Informações Complementares (IS)). Mudas de Arabidopsis foram cultivadas em um meio contendo 50 μM de derivados de ácido ursônico, e o comprimento radicular foi medido, como mostrado na figura. Conforme mostrado nas Figuras 3a, b e S1, os ácidos cumamo apresentam diferentes comprimentos de cadeias alcoxi lineares (9, 10, 11, 12 e 13) ou grandes cadeias alcoxi (15, 16 e 17) na posição N1. Os derivados apresentaram inibição significativa do crescimento radicular. Além disso, constatamos que a aplicação de 200 μM de 10, 11 ou 17 inibiu a germinação (Figuras 3c e S2).
Estudo da relação estrutura-atividade da amida de Kumamoto e compostos relacionados. (a) Estrutura e esquema de síntese de análogos. (b) Quantificação do comprimento da raiz de mudas de 7 dias cultivadas em meio MS com ou sem 50 μM de derivados de cumarona. Asteriscos indicam diferenças significativas com o tratamento simulado (teste t, p< 0,05). n>18. Os dados são apresentados como média ± DP. nt significa “não testado” porque mais de 50% das sementes não germinaram. (c) Quantificação da taxa de germinação de sementes tratadas e incubadas por 7 dias em meio MS com ou sem 200 μM de cumarona e compostos relacionados. Asteriscos indicam diferenças significativas com o tratamento simulado (teste qui-quadrado). n=96.
Curiosamente, a adição de cadeias laterais alquílicas maiores que C9 reduziu a atividade inibitória, sugerindo que compostos relacionados ao ácido kumamotoico requerem cadeias laterais de um certo tamanho para exibir sua atividade biológica.
Como a análise da relação estrutura-atividade mostrou que C9 foi modificado para ácido ursônico e que o derivado noniloxi do ácido ursônico (doravante denominado KAND 11) foi o inibidor de crescimento vegetal mais eficaz, conduzimos uma caracterização mais detalhada de KAND 11. O tratamento de Arabidopsis com 50 μM de KAND 11 preveniu quase completamente a germinação, enquanto concentrações mais baixas (40, 30, 20 ou 10 μM) de KAND 11 inibiram o crescimento radicular de forma dose-dependente (Fig. 4a, b). Para testar se KAND 11 afeta a viabilidade do meristema radicular, examinamos meristemas radiculares corados com iodeto de propídio (PI) e medimos a área do meristema. O tamanho do meristema de mudas cultivadas em um meio contendo 25 μM de KAND-11 foi de 151,1 ± 32,5 μm, enquanto o tamanho do meristema de mudas cultivadas em um meio controle contendo DMSO foi de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), o que indica que KAND-11 restaura a atividade celular. espalhando. Meristema da raiz. Consistente com isso, o tratamento com KAND 11 reduziu a quantidade de sinal do marcador de divisão celular CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS no meristema da raiz (Fig. 4e) 17 . Esses resultados indicam que KAND 11 inibe o crescimento da raiz reduzindo a atividade de proliferação celular.
Análise do efeito inibitório de derivados do ácido urbenônico (derivados urbeniloxi) sobre o crescimento. (a) Mudas de Col selvagem com 7 dias de idade, cultivadas em placas de MS com as concentrações indicadas de KAND 11. Barra de escala = 1 cm. (b) Quantificação do comprimento da raiz. As letras indicam diferenças significativas (teste de Tukey HSD, p< 0,05). n>16. Os dados são apresentados como média ± DP. (c) Microscopia confocal de raízes de Col selvagens coradas com iodeto de propídio, cultivadas em placas de MS com ou sem 25 μM de KAND 11. Os colchetes brancos indicam o meristema da raiz. Barra de escala = 100 µm. (d) Quantificação do tamanho do meristema da raiz (n = 10 a 11). As diferenças estatísticas foram determinadas pelo teste t (p< 0,05). As barras representam o tamanho médio do meristema. (e) Microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) de um meristema de raiz contendo a construção CDKB2; 1pro: CDKB2; corado com 1-GUS e corado em mudas de 5 dias de idade cultivadas em placas de MS com ou sem ensaio KAND de 25 µM.
A fitotoxicidade de KAND 11 foi testada adicionalmente usando outra planta dicotiledônea, o tabaco (Nicotiana tabacum), e um importante organismo modelo de planta terrestre, a hepática (Marchantia polymorpha). Assim como no caso de Arabidopsis, mudas de tabaco SR-1 cultivadas em meio contendo 25 μM de KAND 11 produziram raízes mais curtas (Fig. 5a). Além disso, 40 das 48 sementes germinaram em placas contendo 200 μM de KAND 11, enquanto todas as 48 sementes germinaram em meio com tratamento simulado, indicando que concentrações mais altas de KAND foram significativas (p< 0,05; teste qui-quadrado) inibiu a germinação do tabaco. (Fig. 5b). Além disso, a concentração de KAND 11 que inibiu o crescimento bacteriano em hepática foi semelhante à concentração efetiva em Arabidopsis (Fig. 5c). Esses resultados indicam que KAND 11 pode inibir o crescimento de uma variedade de plantas. Em seguida, investigamos a possível citotoxicidade de compostos relacionados à monoamida de urso em outros organismos, a saber, células HeLa humanas e cepa DH5α de Escherichia coli, como representantes de células animais e bacterianas superiores, respectivamente. Em uma série de ensaios de proliferação celular, observamos que a coumamonamida 1, o ácido coumamonamídico 6 e KAND 11 não afetaram o crescimento de células HeLa ou E. coli em concentrações de 100 μM (Fig. 5d,e).
Inibição do crescimento de KAND 11 em organismos não Arabidopsis. (a) Mudas de tabaco SR-1 selvagem de duas semanas de idade foram cultivadas em placas MS posicionadas verticalmente contendo 25 μM de KAND 11. (b) Mudas de tabaco SR-1 selvagem de duas semanas de idade foram cultivadas em placas MS posicionadas horizontalmente contendo 200 μM de KAND 11. (c) Brotos de hepática Tak-1 selvagem de duas semanas de idade cultivados em placas Gamborg B5 com as concentrações indicadas de KAND 11. As setas vermelhas indicam os esporos que pararam de crescer dentro do período de incubação de duas semanas. (d) Ensaio de proliferação celular de células HeLa. O número de células viáveis foi medido em intervalos de tempo fixos usando um kit de contagem de células 8 (Dojindo). Como controle, as células HeLa foram tratadas com 5 μg/ml de actinomicina D (Act D), que inibe a transcrição da RNA polimerase e causa morte celular. As análises foram realizadas em triplicata. (e) Ensaio de proliferação celular de E. coli. O crescimento de E. coli foi analisado pela medição da OD600. Como controle, as células foram tratadas com 50 μg/ml de ampicilina (Amp), que inibe a síntese da parede celular bacteriana. As análises foram realizadas em triplicata.
Para decifrar o mecanismo de ação da citotoxicidade causada por compostos relacionados à uramida, reanalisamos derivados do ácido urbênico com efeitos inibitórios moderados, como mostrado na figura. Conforme mostrado nas Figuras 2b e 6a, mudas cultivadas em placas de ágar contendo altas concentrações (200 μM) de ácido urmatônico 6 produziram raízes mais curtas e curvadas para a esquerda (θ = – 23,7 ± 6,1), enquanto as mudas cultivadas no meio controle produziram raízes quase retas (θ = – 3,8 ± 7,1). Sabe-se que esse crescimento oblíquo característico resulta da disfunção dos microtúbulos corticais14,18. Consistente com essa descoberta, os fármacos desestabilizadores de microtúbulos disopiramida e orizalina induziram inclinação radicular semelhante em nossas condições de crescimento (Figs. 2b e 6a). Ao mesmo tempo, testamos derivados do ácido urmotônico e selecionamos vários deles que, em certas concentrações, induziram o crescimento oblíquo da raiz. Os compostos 8, 9 e 15 alteraram a direção do crescimento da raiz em 75 μM, 50 μM e 40 μM, respectivamente, indicando que esses compostos podem efetivamente desestabilizar os microtúbulos (Fig. 2b, 6a). Também testamos o derivado mais potente do ácido ursólico, KAND 11, em uma concentração mais baixa (15 μM) e descobrimos que a aplicação de KAND 11 inibiu o crescimento da raiz e que a direção do crescimento da raiz foi irregular, embora tendessem a inclinar-se para a esquerda (Figura C3). Como concentrações mais altas de fármacos desestabilizadores de microtúbulos às vezes inibem o crescimento da planta em vez de causar inclinação da raiz, subsequentemente avaliamos a possibilidade de que KAND 11 afete os microtúbulos observando microtúbulos corticais em células epidérmicas da raiz. A imuno-histoquímica utilizando anticorpos anti-β-tubulina em células epidérmicas de raízes de plântulas tratadas com 25 μM de KAND 11 demonstrou o desaparecimento de quase todos os microtúbulos corticais em células epidérmicas na zona de alongamento (Fig. 6b). Esses resultados indicam que o ácido kumamotonico e seus derivados atuam direta ou indiretamente sobre os microtúbulos, rompendo-os, e que esses compostos são novos inibidores de microtúbulos.
O ácido ursônico e seus derivados alteram os microtúbulos corticais em Arabidopsis thaliana. (a) Ângulo de inclinação da raiz medido na presença de vários derivados do ácido ursônico nas concentrações indicadas. Os efeitos de dois compostos conhecidos por inibir os microtúbulos: disopiramida e orizalina também foram analisados. O detalhe mostra o padrão utilizado para medir o ângulo de crescimento da raiz. Os asteriscos indicam diferenças significativas com o tratamento simulado (teste t, p< 0,05). n>19. Barra de escala = 1 cm. (b) Microtúbulos corticais em células epidérmicas na zona de alongamento. Microtúbulos em raízes de Arabidopsis Col de tipo selvagem cultivadas em placas de MS com ou sem 25 μM de KAND 11 foram visualizados por imuno-histoquímica usando anticorpos primários de β-tubulina e anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor. Barra de escala = 10 µm. (c) Estrutura mitótica dos microtúbulos no meristema da raiz. Os microtúbulos foram visualizados por imuno-histoquímica. Estruturas mitóticas, incluindo zonas de prófase, fusos e fragmoplastos, foram contadas a partir de imagens confocais. As setas indicam estruturas de microtúbulos mitóticos. Asteriscos indicam diferenças significativas com o tratamento simulado (teste t, p< 0,05). n>9. Barra de escala = 50 µm.
Embora Ursa tenha a capacidade de interromper a função dos microtúbulos, espera-se que seu mecanismo de ação seja diferente do de agentes despolimerizantes de microtúbulos típicos. Por exemplo, concentrações mais altas de agentes despolimerizantes de microtúbulos, como disopiramida e orizalina, induzem expansão anisotrópica de células epidérmicas, enquanto KAND 11 não. Além disso, a coaplicação de KAND 11 e disopiramida resultou em uma resposta combinada de crescimento radicular induzida por disopiramida e foi observada inibição do crescimento induzida por KAND 11 (Fig. S4). Também analisamos a resposta do mutante hipersensível à disopiramida 1-1 (phs1-1) ao KAND 11. phs1-1 possui uma mutação pontual não canônica da tubulina quinase e produz raízes mais curtas quando tratado com disopiramida9,20. Mudas do mutante phs1-1 cultivadas em meio ágar contendo KAND 11 apresentaram raízes mais curtas, semelhantes às cultivadas em disopiramida (Fig. S5).
Além disso, observamos estruturas de microtúbulos mitóticos, como zonas de prófase, fusos e fragmoplastos, no meristema da raiz de mudas tratadas com KAND 11. Consistente com as observações para CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, uma diminuição significativa no número de microtúbulos mitóticos foi observada (Fig. .6c).
Para caracterizar a citotoxicidade de KAND 11 em resolução subcelular, tratamos células de suspensão BY-2 de tabaco com KAND 11 e observamos sua resposta. Primeiro, adicionamos KAND 11 a células BY-2 expressando TagRFP-TUA6, que marca microtúbulos fluorescentemente, para avaliar o efeito de KAND 11 em microtúbulos corticais. A densidade de microtúbulos corticais foi avaliada usando análise de imagem, que quantificou a porcentagem de pixels citoesqueléticos entre pixels citoplasmáticos. Os resultados do ensaio mostraram que após o tratamento com 50 μM ou 100 μM de KAND 11 por 1 hora, a densidade diminuiu significativamente para 0,94 ± 0,74% ou 0,23 ± 0,28%, respectivamente, enquanto a densidade de células tratadas com DMSO foi de 1,61 ± 0,34% (Fig. 7a). Esses resultados são consistentes com a observação em Arabidopsis de que o tratamento com KAND 11 induz a despolimerização de microtúbulos corticais (Fig. 6b). Também examinamos a linhagem BY-2 com filamentos de actina marcados com GFP-ABD após tratamento com a mesma concentração de KAND 11 e observamos que o tratamento com KAND 11 rompeu os filamentos de actina. O tratamento com 50 μM ou 100 μM de KAND 11 por 1 h reduziu significativamente a densidade dos filamentos de actina para 1,20 ± 0,62% ou 0,61 ± 0,26%, respectivamente, enquanto a densidade em células tratadas com DMSO foi de 1,69 ± 0,51% (Fig. 2). 7b). Esses resultados contrastam com os efeitos da propizamida, que não afeta os filamentos de actina, e da latrunculina B, um despolimerizador de actina que não afeta os microtúbulos (SI Figura S6). Além disso, o tratamento com coumamonamida 1, ácido coumamonamida 6 ou KAND 11 não afetou os microtúbulos em células HeLa (Figura S7 do SI). Assim, acredita-se que o mecanismo de ação de KAND 11 seja diferente daquele de desreguladores citoesqueléticos conhecidos. Além disso, nossa observação microscópica de células BY-2 tratadas com KAND 11 revelou o início da morte celular durante o tratamento com KAND 11 e mostrou que a proporção de células mortas coradas com azul de Evans não aumentou significativamente após 30 minutos de tratamento com KAND 11, enquanto após 90 minutos de tratamento com 50 μM ou 100 μM de KAND, o número de células mortas aumentou para 43,7% ou 80,1%, respectivamente (Fig. 7c). Tomados em conjunto, esses dados indicam que o novo derivado do ácido ursólico KAND 11 é um inibidor citoesquelético específico de plantas com um mecanismo de ação previamente desconhecido.
KAND afeta microtúbulos corticais, filamentos de actina e a viabilidade de células BY-2 de tabaco. (a) Visualização de microtúbulos corticais em células BY-2 na presença de TagRFP-TUA6. Células BY-2 tratadas com KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO foram examinadas por microscopia confocal. A densidade de microtúbulos corticais foi calculada a partir de micrografias de 25 células independentes. As letras indicam diferenças significativas (teste de Tukey HSD, p< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (b) Filamentos de actina cortical em células BY-2 visualizados na presença de GFP-ABD2. Células BY-2 tratadas com KAND 11 (50 µM ou 100 µM) ou DMSO foram examinadas por microscopia confocal. A densidade dos filamentos de actina cortical foi calculada a partir de micrografias de 25 células independentes. As letras indicam diferenças significativas (teste de Tukey HSD, p< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (c) Observação de células BY-2 mortas por coloração com azul de Evans. Células BY-2 tratadas com KAND 11 (50 µM ou 100 µM) ou DMSO foram examinadas por microscopia de campo claro. n=3. Barra de escala = 100 µm.
A descoberta e a aplicação de novos produtos naturais levaram a avanços significativos em vários aspectos da vida humana, incluindo a medicina e a agricultura. Pesquisas históricas têm sido realizadas para obter compostos úteis a partir de recursos naturais. Em particular, os actinomicetos são conhecidos por serem úteis como antibióticos antiparasitários para nematoides devido à sua capacidade de produzir vários metabólitos secundários, como a avermectina, o principal composto da ivermectina e da bleomicina e seus derivados, usados medicinalmente como um agente anticancerígeno21,22. Da mesma forma, uma variedade de compostos herbicidas foram descobertos a partir de actinomicetos, alguns dos quais já são usados comercialmente1,23. Portanto, a análise de metabólitos de actinomicetos para isolar produtos naturais com atividades biológicas desejadas é considerada uma estratégia eficaz. Neste estudo, descobrimos um novo composto, a coumamonamida, de S. werraensis e o sintetizamos com sucesso. O ácido ursônico é um intermediário sintético da urbenamida e seus derivados. Pode causar o enrolamento característico das raízes, apresentar atividade herbicida moderada a forte e danificar direta ou indiretamente os microtúbulos das plantas. No entanto, o mecanismo de ação do ácido urmatônico pode diferir daquele dos inibidores de microtúbulos existentes, visto que o KAND 11 também rompe os filamentos de actina e causa morte celular, sugerindo um mecanismo regulador pelo qual o ácido urmatônico e seus derivados influenciam uma ampla gama de estruturas citoesqueléticas.
Uma caracterização mais detalhada do ácido urbenônico ajudará a compreender melhor o mecanismo de ação do ácido urbenônico. Em particular, o próximo objetivo é avaliar a capacidade do ácido urbenônico de se ligar a microtúbulos reduzidos para determinar se o ácido urbenônico e seus derivados atuam diretamente sobre os microtúbulos e os despolimerizam, ou se sua ação resulta na desestabilização dos microtúbulos. Além disso, no caso em que os microtúbulos não são um alvo direto, a identificação do sítio de ação e dos alvos moleculares do ácido urbenônico em células vegetais ajudará a compreender melhor as propriedades de compostos relacionados e possíveis maneiras de melhorar a atividade herbicida. Nosso ensaio de bioatividade revelou a capacidade citotóxica única do ácido urbenônico no crescimento de plantas como Arabidopsis thaliana, tabaco e hepática, enquanto nem as células de E. coli nem as células HeLa foram afetadas. Pouca ou nenhuma toxicidade para células animais é uma vantagem dos derivados do ácido ursônico se eles forem desenvolvidos como herbicidas para uso em campos agrícolas abertos. De fato, como os microtúbulos são estruturas comuns em eucariotos, sua inibição seletiva em plantas é um requisito fundamental para herbicidas. Por exemplo, a propizamida, um agente despolimerizante de microtúbulos que se liga diretamente à tubulina e inibe a polimerização, é usada como herbicida devido à sua baixa toxicidade para células animais24. Em contraste com a disopiramida, as benzamidas relacionadas têm diferentes especificidades de alvo. Além dos microtúbulos vegetais, o RH-4032 ou benzoxamida também inibe microtúbulos de células animais ou oomicetos, respectivamente, e a zalilamida é usada como fungicida devido à sua baixa fitotoxicidade25,26,27. O urso recém-descoberto e seus derivados exibem citotoxicidade seletiva contra plantas, mas vale ressaltar que modificações adicionais podem alterar sua especificidade de alvo, potencialmente fornecendo derivados adicionais para o controle de fungos patogênicos ou oomicetos.
As propriedades únicas do ácido urbenônico e seus derivados são úteis para seu desenvolvimento como herbicidas e uso como ferramentas de pesquisa. A importância do citoesqueleto no controle da forma da célula vegetal é amplamente reconhecida. Estudos anteriores demonstraram que as plantas desenvolveram mecanismos complexos de organização dos microtúbulos corticais, controlando a dinâmica dos microtúbulos para controlar adequadamente a morfogênese. Um grande número de moléculas responsáveis pela regulação da atividade dos microtúbulos foi identificado, e pesquisas relacionadas ainda estão em andamento3,4,28. Nossa compreensão atual da dinâmica dos microtúbulos em células vegetais não explica completamente os mecanismos de organização dos microtúbulos corticais. Por exemplo, embora tanto a disopiramida quanto a orizalina possam despolimerizar os microtúbulos, a disopiramida causa distorção grave da raiz, enquanto a orizalina tem um efeito relativamente brando. Além disso, mutações na tubulina, que estabiliza os microtúbulos, também causam dextrorrotação nas raízes, enquanto o paclitaxel, que também estabiliza a dinâmica dos microtúbulos, não. Portanto, estudar e identificar os alvos moleculares do ácido ursólico deve fornecer novos insights sobre a regulação dos microtúbulos corticais das plantas. Da mesma forma, futuras comparações entre substâncias químicas eficazes na promoção do crescimento distorcido, como a disopiramida, e substâncias químicas menos eficazes, como a orizalina ou o ácido kumamotórico, fornecerão pistas sobre como o crescimento distorcido ocorre.
Por outro lado, rearranjos citoesqueléticos relacionados à defesa são outra possibilidade para explicar a citotoxicidade do ácido ursônico. A infecção por um patógeno ou a introdução de um elicitor em células vegetais às vezes causa a destruição do citoesqueleto e subsequente morte celular29. Por exemplo, foi relatado que a criptoxantina derivada de oomicetos rompe microtúbulos e filamentos de actina antes da morte de células de tabaco, semelhante ao que ocorre com o tratamento com KAND30,31. As semelhanças entre as respostas de defesa e as respostas celulares induzidas pelo ácido ursônico nos levaram a hipotetizar que elas desencadeiam processos celulares comuns, embora um efeito mais rápido e mais forte do ácido ursônico do que da criptoxantina seja evidente. No entanto, estudos demonstraram que a ruptura dos filamentos de actina promove a morte celular espontânea, que nem sempre é acompanhada pela ruptura dos microtúbulos29. Além disso, ainda não se sabe se o patógeno ou o elicitor causam crescimento radicular distorcido, como os derivados do ácido ursônico. Assim, o conhecimento molecular que liga as respostas de defesa e o citoesqueleto é um problema atraente a ser abordado. Ao explorar a presença de compostos de baixo peso molecular relacionados ao ácido ursônico, bem como uma variedade de derivados com potências variadas, eles podem fornecer oportunidades para atingir mecanismos celulares desconhecidos.
Em conjunto, a descoberta e a aplicação de novos compostos que modulam a dinâmica dos microtúbulos fornecerão métodos poderosos para abordar os complexos mecanismos moleculares subjacentes à determinação da forma das células vegetais. Nesse contexto, o composto recentemente desenvolvido, ácido urmotônico, que afeta os microtúbulos e os filamentos de actina e induz a morte celular, pode proporcionar uma oportunidade para decifrar a conexão entre o controle dos microtúbulos e esses outros mecanismos. Assim, análises químicas e biológicas com ácido urmotônico nos ajudarão a compreender os mecanismos regulatórios moleculares que controlam o citoesqueleto vegetal.
Inocular S. werraensis MK493-CF1 em um erlenmeyer defletor de 500 mL contendo 110 mL de meio de cultura composto por 2% (p/v) de galactose, 2% (p/v) de pasta de essência e 1% (p/v) de composição de bacto-soja (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (p/v) de extrato de milho (KOGOSTCH Co., Ltd., Japão), 0,2% (p/v) de (NH4)2SO4 e 0,2% de CaCO3 em água deionizada (pH 7,4 antes da esterilização). As culturas de sementes foram incubadas em um agitador rotativo (180 rpm) a 27 °C por 2 dias. Cultivo de produção por fermentação em estado sólido. A cultura de sementes (7 ml) foi transferida para um frasco K-1 de 500 ml contendo 40 g de meio de produção composto por 15 g de cevada prensada (MUSO Co., Ltd., Japão) e 25 g de água deionizada (pH não ajustado antes da esterilização). A fermentação foi realizada a 30 °C no escuro por 14 dias. O material de fermentação foi extraído com 40 ml/garrafa de EtOH e centrifugado (1500 g, 4 °C, 10 min). O sobrenadante da cultura (60 ml) foi extraído com uma mistura de 10% de MeOH/EtOAc. A camada orgânica foi evaporada sob pressão reduzida para obter um resíduo (59,5 mg), que foi submetido a HPLC com eluição em gradiente (0–10 minutos: 90%) em uma coluna de fase reversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × comprimento 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutos: 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35–45 minutos: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutos: 90% H2O/EtOH a 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155–200 min: 100% EtOH) a uma vazão de 1,5 ml/min, a coumamonamida (1, 36,0 mg) foi isolada como um pó branco amorfo.
Kumamotoamida(1); 1H-RMN (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor calculado: 141,0659, valor medido: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
As sementes de Columbia (Col-0) foram obtidas do Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) com permissão para uso em pesquisa. As sementes de Col-0 foram propagadas e mantidas em nossas condições de laboratório e usadas como plantas de Arabidopsis do tipo selvagem. As sementes de Arabidopsis foram esterilizadas na superfície e cultivadas em meio Murashige e Skoog com metade da concentração contendo 2% de sacarose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (p/v) de ácido 2-(4-morfolino)etanossulfônico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) e 1,5% de ágar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C e luz constante. As sementes do mutante phs1-1 foram fornecidas por T. Hashimoto (Instituto de Ciência e Tecnologia de Nara).
As sementes da cepa SR-1 foram fornecidas por T. Hashimoto (Instituto de Ciência e Tecnologia de Nara) e utilizadas como plantas de tabaco selvagem. As sementes de tabaco foram esterilizadas superficialmente e embebidas em água estéril por três noites para promover a germinação. Em seguida, foram colocadas em uma solução com metade da concentração contendo 2% de sacarose, 0,05% (p/v) de MES e 0,8% de goma gelana (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige e meio Skoog) com pH 5,7 e incubadas a 23 °C sob luz constante.
A cepa Tak-1 foi fornecida por T. Kohchi (Universidade de Kyoto) e utilizada como unidade experimental padrão para o estudo da hepática. A gema foi obtida de plantas cultivadas esterilizadas e, em seguida, semeada em meio Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) contendo 1% de sacarose e 0,3% de goma gelana e incubada a 23 °C sob luz contínua.
Células BY-2 de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) foram fornecidas por S. Hasezawa (Universidade de Tóquio). As células BY-2 foram diluídas 95 vezes em meio Linsmeier e Skoog modificado e suplementadas semanalmente com ácido 2,4-diclorofenoxiacético 32 . A suspensão celular foi misturada em um agitador rotativo a 130 rpm a 27 °C no escuro. Lave as células com 10 vezes o volume de meio fresco e ressuspenda no mesmo meio. As linhagens celulares transgênicas BY-2 expressando de forma estável o marcador de microtúbulos TagRFP-TUA6 ou o marcador de filamento de actina GFP-ABD2 sob o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor foram geradas conforme descrito 33,34,35. Essas linhagens celulares podem ser mantidas e sincronizadas usando procedimentos semelhantes aos usados para a linhagem celular BY-2 original.
As células HeLa foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 1,2 U/ml de penicilina e 1,2 μg/ml de estreptomicina em uma incubadora a 37°C com 5% de CO2.
Todos os experimentos descritos neste manuscrito foram realizados de acordo com as normas e diretrizes japonesas de biossegurança.
Os compostos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) como soluções estoque e diluídos em meio MS para Arabidopsis e tabaco ou meio Gamborg B5 para hepática. Para o ensaio de inibição do crescimento radicular, mais de 10 sementes por placa foram semeadas em meio ágar contendo os compostos indicados ou DMSO. As sementes foram incubadas em uma câmara de crescimento por 7 dias. As plântulas foram fotografadas e o comprimento das raízes foi medido. Para o ensaio de germinação de Arabidopsis, 48 sementes por placa foram semeadas em meio ágar contendo 200 μM de composto ou DMSO. As sementes de Arabidopsis foram cultivadas em uma câmara de crescimento e o número de plântulas germinadas foi contado 7 dias após a germinação (dag). Para o ensaio de germinação de tabaco, 24 sementes por placa foram semeadas em meio ágar contendo 200 μM de KAND ou DMSO. Sementes de tabaco foram cultivadas em câmara de crescimento e o número de plântulas germinadas foi contado após 14 dias. Para o ensaio de inibição do crescimento de hepáticas, 9 embriões de cada placa foram semeados em meio ágar contendo as concentrações indicadas de KAND ou DMSO e incubados em câmara de crescimento por 14 dias.
Utilize mudas coradas com 5 mg/ml de iodeto de propídio (IP) para visualizar a organização do meristema radicular. Os sinais de IP foram observados por microscopia de fluorescência usando um microscópio confocal de varredura a laser TCS SPE (Leica Microsystems).
A coloração histoquímica das raízes com β-glucuronidase (GUS) foi realizada de acordo com o protocolo descrito por Malami e Benfey36. As plântulas foram fixadas em acetona a 90% durante a noite, coradas com 0,5 mg/ml de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucurônico em tampão GUS por 1 hora e colocadas em uma solução de cloraldeído hidratado (8 g de hidrato de cloral, 2 ml de água e 1 ml de glicerol) e observadas por microscopia de contraste de interferência diferencial usando um microscópio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Os ângulos das raízes foram medidos em mudas de 7 dias de idade, cultivadas em placas posicionadas verticalmente. Meça o ângulo da raiz a partir da direção do vetor de gravidade, conforme descrito na etapa 6.
O arranjo dos microtúbulos corticais foi observado conforme descrito, com pequenas modificações no protocolo 37 . O anticorpo anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) e o anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado com Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) foram usados como anticorpos primários e secundários em diluições de 1:1000 e 1:100, respectivamente. As imagens de fluorescência foram adquiridas usando um microscópio de varredura a laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Adquira imagens em Z-stack e crie projeções de intensidade máxima de acordo com as instruções do fabricante.
O ensaio de proliferação de células HeLa foi realizado usando o Cell Counting Kit 8 (Dojindo) de acordo com as instruções do fabricante.
O crescimento de E. coli DH5α foi analisado medindo a densidade celular em cultura usando um espectrofotômetro a 600 nm (OD600).
A organização citoesquelética em células BY-2 transgênicas foi observada usando um microscópio de fluorescência equipado com um dispositivo de varredura confocal CSU-X1 (Yokogawa) e uma câmera sCMOS (Zyla, Andor Technology). A densidade citoesquelética foi avaliada por análise de imagem, que quantificou a porcentagem de pixels citoesqueléticos entre os pixels citoplasmáticos em imagens confocais usando o software ImageJ, conforme descrito38,39.
Para detectar a morte celular em células BY-2, uma alíquota da suspensão celular foi incubada com 0,05% de azul de Evans por 10 minutos à temperatura ambiente. A coloração seletiva de células mortas com azul de Evans depende da extrusão do corante das células viáveis pela membrana plasmática intacta40. As células coradas foram observadas usando um microscópio de campo claro (BX53, Olympus).
As células HeLa foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de SFB em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2. As células foram tratadas com 100 μM de KAND 11, ácido kumamonâmico 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml de colcemid (Gibco) ou 100 ng/ml de Nocodmaze (Sigma) por 6 h a 37 °C. As células foram fixadas com MetOH por 10 min e, em seguida, com acetato por 5 min à temperatura ambiente. As células fixadas foram incubadas com anticorpo primário de β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluído em 0,5% de BSA/PBS por 2 horas, lavadas 3 vezes com TBST e, em seguida, incubadas com anticorpo de cabra Alexa Fluor. 488 por 1 hora. – IgG de camundongo (Thermo Fisher Scientific: A11001) e 15 ng/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluídos em 0,5% de BSA/PBS. Após três lavagens com TBST, as células coradas foram observadas em um microscópio invertido Nikon Eclipse Ti-E. As imagens foram capturadas com uma câmera CCD Hamamatsu ORCA-R2 resfriada, utilizando o software MetaMorph (Molecular Devices).
Horário da publicação: 17/06/2024