O nematoide do pinheiro é um endoparasita migratório quarentenário conhecido por causar graves perdas econômicas em ecossistemas florestais de pinheiros. O presente estudo analisa a atividade nematicida de indóis halogenados contra nematoides do pinheiro e seu mecanismo de ação. As atividades nematicidas de 5-iodoindol e avermectina (controle positivo) contra nematoides do pinheiro foram semelhantes e elevadas em baixas concentrações (10 μg/mL). O 5-iodoindol reduziu a fecundidade, a atividade reprodutiva, a mortalidade embrionária e larval e o comportamento locomotor. As interações moleculares de ligantes com receptores de canais de cloreto dependentes de glutamato específicos para invertebrados sustentam a noção de que o 5-iodoindol, assim como a avermectina, liga-se fortemente ao sítio ativo do receptor. O 5-iodoindol também induziu várias deformações fenotípicas em nematoides, incluindo colapso/encolhimento anormal de órgãos e aumento da vacuolização. Esses resultados sugerem que os vacúolos podem desempenhar um papel na morte mediada pela metilação de nematoides. É importante ressaltar que o 5-iodoindol não foi tóxico para ambas as espécies de plantas (repolho e rabanete). Assim, este estudo demonstra que a aplicação de iodoindol em condições ambientais pode controlar os danos causados pela murcha do pinheiro.
O nematoide da madeira do pinheiro (Bursaphelenchus xylophilus) pertence aos nematoides da madeira do pinheiro (NMP), nematoides endoparasitários migratórios conhecidos por causar danos ecológicos severos aos ecossistemas de florestas de pinheiros1. A doença da murcha do pinheiro (DMP), causada pelo nematoide da madeira do pinheiro, está se tornando um problema sério em vários continentes, incluindo Ásia e Europa, e na América do Norte, o nematoide destrói espécies de pinheiros introduzidas1,2. O declínio dos pinheiros é um grande problema econômico, e a perspectiva de sua disseminação global é preocupante3. As seguintes espécies de pinheiros são mais comumente atacadas pelo nematoide: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii e Pinus radiata4. O nematoide do pinheiro é uma doença grave que pode matar pinheiros dentro de semanas ou meses de infecção. Além disso, surtos de nematoides do pinheiro são comuns em uma variedade de ecossistemas, então cadeias de infecção persistentes foram estabelecidas1.
Bursaphelenchus xylophilus é um nematoide parasita de plantas quarentenário pertencente à superfamília Aphelenchoidea e clado 102.5. O nematoide alimenta-se de fungos e reproduz-se nos tecidos lenhosos dos pinheiros, desenvolvendo-se em quatro estágios larvais diferentes: L1, L2, L3, L4 e um indivíduo adulto1,6. Em condições de escassez de alimento, o nematoide do pinheiro passa para um estágio larval especializado – dauer, que parasita seu vetor – o besouro da casca do pinheiro (Monochamus alternatus) e é transferido para pinheiros saudáveis. Em hospedeiros saudáveis, os nematoides migram rapidamente pelos tecidos vegetais e se alimentam de células parenquimatosas, o que leva a uma série de reações de hipersensibilidade, murcha do pinheiro e morte dentro de um ano após a infecção1,7,8.
O controle biológico de nematoides do pinheiro tem sido um desafio há muito tempo, com medidas de quarentena que datam do século XX. As estratégias atuais para controlar nematoides do pinheiro envolvem principalmente tratamentos químicos, incluindo fumigação de madeira e implantação de nematicidas em troncos de árvores. Os nematicidas mais comumente usados são a avermectina e o benzoato de avermectina, que pertencem à família das avermectinas. Esses produtos químicos caros são altamente eficazes contra muitas espécies de nematoides e são considerados ambientalmente seguros9. No entanto, espera-se que o uso repetido desses nematicidas crie uma pressão de seleção que quase certamente levará ao surgimento de nematoides do pinheiro resistentes, como foi demonstrado para várias pragas de insetos, como Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella e os nematoides Trichostrongylus colubriformis e Ostertagia circumcincta, que gradualmente desenvolveram resistência às avermectinas10,11,12. Portanto, os padrões de resistência precisam ser estudados regularmente e os nematicidas devem ser testados continuamente para encontrar medidas alternativas, econômicas e ecologicamente corretas para controlar a DVP. Nas últimas décadas, diversos autores têm proposto o uso de extratos vegetais, óleos essenciais e voláteis como agentes de controle de nematoides13,14,15,16.
Recentemente demonstramos a atividade nematicida do indol, uma molécula de sinalização intercelular e inter-reino, em Caenorhabditis elegans 17 . O indol é um sinal intracelular amplamente difundido na ecologia microbiana, controlando inúmeras funções que afetam a fisiologia microbiana, a formação de esporos, a estabilidade do plasmídeo, a resistência a medicamentos, a formação de biofilme e a virulência 18, 19 . A atividade do indol e seus derivados contra outros nematoides patogênicos não foi estudada. Neste estudo, investigamos a atividade nematicida de 34 indóis contra nematoides do pinheiro e elucidamos o mecanismo de ação do 5-iodoindol mais potente usando microscopia, fotografia de lapso de tempo e experimentos de encaixe molecular, e avaliamos seus efeitos tóxicos em plantas usando um ensaio de germinação de sementes.
Altas concentrações (> 1,0 mM) de indol foram previamente relatadas como tendo um efeito nematicida em nematoides17. Após o tratamento de B. xylophilus (estágios de vida mistos) com indol ou 33 diferentes derivados de indol a 1 mM, a mortalidade de B. xylophilus foi medida pela contagem de nematoides vivos e mortos nos grupos controle e tratado. Cinco indóis exibiram atividade nematicida significativa; a sobrevivência do grupo controle não tratado foi de 95 ± 7% após 24 h. Dos 34 indóis testados, 5-iodoindol e 4-fluoroindol a 1 mM causaram 100% de mortalidade, enquanto 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-carboxilato e 7-iodoindol causaram aproximadamente 50% de mortalidade (Tabela 1).
Efeito do 5-iodoindol na formação de vacúolos e no metabolismo do nematoide da madeira do pinheiro. (A) Efeito da avermectina e do 5-iodoindol em nematoides machos adultos, (B) ovos do nematoide em estágio L1 e (C) metabolismo de B. xylophilus, (i) vacúolos não foram observados em 0 h, o tratamento resultou em (ii) vacúolos, (iii) acúmulo de múltiplos vacúolos, (iv) inchaço dos vacúolos, (v) fusão dos vacúolos e (vi) formação de vacúolos gigantes. As setas vermelhas indicam o inchaço dos vacúolos, as setas azuis indicam a fusão dos vacúolos e as setas pretas indicam vacúolos gigantes. Barra de escala = 50 μm.
Além disso, este estudo também descreveu o processo sequencial de morte induzida por metano em nematoides do pinheiro (Figura 4C). A morte metanogênica é um tipo não apoptótico de morte celular associada ao acúmulo de vacúolos citoplasmáticos proeminentes27. Os defeitos morfológicos observados em nematoides do pinheiro parecem estar intimamente relacionados ao mecanismo de morte induzida por metano. O exame microscópico em diferentes momentos mostrou que vacúolos gigantes foram formados após 20 h de exposição a 5-iodoindol (0,1 mM). Vacúolos microscópicos foram observados após 8 h de tratamento e seu número aumentou após 12 h. Vários vacúolos grandes foram observados após 14 h. Vários vacúolos fundidos eram claramente visíveis após 12–16 h de tratamento, indicando que a fusão de vacúolos é a base do mecanismo de morte metanogênica. Após 20 horas, vários vacúolos gigantes foram encontrados em todo o verme. Essas observações representam o primeiro relato de metuose em C. elegans.
Em vermes tratados com 5-iodoindol, também foram observadas agregação e ruptura de vacúolos (Fig. 5), evidenciadas pela flexão do verme e liberação de vacúolos no ambiente. A ruptura de vacúolos também foi observada na membrana da casca do ovo, que normalmente é preservada intacta pelo L2 durante a eclosão (Fig. S2 Suplementar). Essas observações corroboram o envolvimento do acúmulo de fluido e da falha osmorregulatória, bem como da lesão celular reversível (LCR), no processo de formação e supuração de vacúolos (Fig. 5).
Hipotetizando o papel do iodo na formação de vacúolos observada, investigamos a atividade nematicida do iodeto de sódio (NaI) e do iodeto de potássio (KI). No entanto, em concentrações (0,1, 0,5 ou 1 mM), eles não afetaram a sobrevivência do nematoide nem a formação de vacúolos (Fig. S5 Suplementar), embora 1 mM de KI tenha tido um leve efeito nematicida. Por outro lado, o 7-iodoindol (1 ou 2 mM), assim como o 5-iodoindol, induziu múltiplos vacúolos e deformações estruturais (Fig. S6 Suplementar). Os dois iodoindois apresentaram características fenotípicas semelhantes em nematoides do pinheiro, enquanto NaI e KI não. Curiosamente, o indol não induziu a formação de vacúolos em B. xylophilus nas concentrações testadas (dados não mostrados). Assim, os resultados confirmaram que o complexo indol-iodo é responsável pela vacuolização e metabolismo de B. xylophilus.
Entre os indóis testados para atividade nematicida, o 5-iodoindol apresentou o maior índice de deslizamento, de -5,89 kcal/mol, seguido pelo 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) e indol (-4,03) (Figura 6). A forte ligação de hidrogênio do 5-iodoindol à leucina 218 estabiliza sua ligação, enquanto todos os outros derivados de indol se ligam à serina 260 por meio de ligações de hidrogênio da cadeia lateral. Entre outros iodoindóis modelados, o 2-iodoindóis tem um valor de ligação de -5,248 kcal/mol, que se deve à sua principal ligação de hidrogênio com a leucina 218. Outras ligações conhecidas incluem 3-iodoindóis (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindóis (-4,0 kcal/mol) e 6-fluoroindóis (-2,6 kcal/mol) (Figura Suplementar S8). A maioria dos indóis halogenados e o próprio indol, com exceção do 5-iodoindol e do 2-iodoindol, formam uma ligação com a serina 260. O fato de a ligação de hidrogênio com a leucina 218 ser indicativa de uma ligação receptor-ligante eficiente, como observado para a ivermectina (Fig. S7 Suplementar), confirma que o 5-iodoindol e o 2-iodoindol, assim como a ivermectina, ligam-se firmemente ao sítio ativo do receptor GluCL via leucina 218 (Fig. 6 e Fig. S8 Suplementar). Propomos que essa ligação seja necessária para manter a estrutura de poros abertos do complexo GluCL e que, ao se ligarem firmemente ao sítio ativo do receptor GluCL, o 5-iodoindol, o 2-iodoindol, a avermectina e a ivermectina mantêm o canal iônico aberto e permitem a captação de fluidos.
Ancoragem molecular de indol e indol halogenado ao GluCL. Orientações de ligação dos ligantes (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol e (D) 5-iodoindol ao sítio ativo do GluCL. A proteína é representada por uma fita, e as ligações de hidrogênio da estrutura principal são mostradas como linhas pontilhadas amarelas. (A'), (B'), (C') e (D') mostram as interações dos ligantes correspondentes com os resíduos de aminoácidos circundantes, e as ligações de hidrogênio da cadeia lateral são indicadas por setas pontilhadas rosa.
Experimentos foram conduzidos para avaliar o efeito tóxico do 5-iodoindol na germinação de sementes de repolho e rabanete. 5-iodoindol (0,05 ou 0,1 mM) ou avermectina (10 μg/mL) tiveram pouco ou nenhum efeito na germinação inicial e na emergência das plântulas (Figura 7). Além disso, nenhuma diferença significativa foi encontrada entre a taxa de germinação de controles não tratados e sementes tratadas com 5-iodoindol ou avermectina. O efeito no alongamento da raiz axial e no número de raízes laterais formadas foi insignificante, embora 1 mM (10 vezes sua concentração ativa) de 5-iodoindol tenha atrasado ligeiramente o desenvolvimento das raízes laterais. Esses resultados indicam que o 5-iodoindol não é tóxico para as células vegetais e não interfere nos processos de desenvolvimento das plantas nas concentrações estudadas.
Efeito do 5-iodoindol na germinação de sementes. Germinação, brotação e enraizamento lateral de sementes de B. oleracea e R. raphanistrum em meio ágar Murashige e Skoog com ou sem avermectina ou 5-iodoindol. A germinação foi registrada após 3 dias de incubação a 22 °C.
Este estudo relata vários casos de morte de nematoides por indóis. É importante ressaltar que este é o primeiro relato de metilação induzida por iodoindol (um processo causado pelo acúmulo de pequenos vacúolos que gradualmente se fundem em vacúolos gigantes, levando à ruptura da membrana e morte) em agulhas de pinheiro, com o iodoindol exibindo propriedades nematicidas significativas, semelhantes às do nematicida comercial avermectina.
Indóis já foram relatados como exercendo múltiplas funções de sinalização em procariotos e eucariotos, incluindo inibição/formação de biofilme, sobrevivência bacteriana e patogenicidade19,32,33,34. Recentemente, os potenciais efeitos terapêuticos de indóis halogenados, alcaloides indólicos e derivados semissintéticos de indóis têm atraído amplo interesse em pesquisas35,36,37. Por exemplo, indóis halogenados demonstraram matar células persistentes de Escherichia coli e Staphylococcus aureus37. Além disso, é de interesse científico estudar a eficácia de indóis halogenados contra outras espécies, gêneros e reinos, e este estudo é um passo em direção a esse objetivo.
Aqui, propomos um mecanismo para a letalidade induzida por 5-iodoindol em C. elegans, baseado em lesão celular reversível (LCR) e metilação (Figuras 4C e 5). Alterações edematosas, como inchaço e degeneração vacuolar, são indicadores de LCR e metilação, manifestando-se como vacúolos gigantes no citoplasma48,49. A LCR interfere na produção de energia, reduzindo a produção de ATP, causando falha da bomba de ATPase ou rompendo as membranas celulares e causando um rápido influxo de Na+, Ca2+ e água50,51,52. Vacúolos intracitoplasmáticos surgem em células animais como resultado do acúmulo de fluido no citoplasma devido ao influxo de Ca2+ e água53. Curiosamente, esse mecanismo de dano celular é reversível se o dano for temporário e as células começarem a produzir ATP por um certo período de tempo, mas se o dano persistir ou piorar, as células morrem.54 Nossas observações mostram que os nematoides tratados com 5-iodoindol são incapazes de restaurar a biossíntese normal após a exposição a condições de estresse.
O fenótipo de metilação induzido por 5-iodoindol em B. xylophilus pode ser devido à presença de iodo e à sua distribuição molecular, uma vez que o 7-iodoindol apresentou menor efeito inibitório em B. xylophilus do que o 5-iodoindol (Tabela 1 e Figura Suplementar S6). Esses resultados são parcialmente consistentes com os estudos de Maltese et al. (2014), que relataram que a translocação da porção de nitrogênio piridílico no indol da posição para para a meta aboliu a vacuolização, a inibição do crescimento e a citotoxicidade em células U251, sugerindo que a interação da molécula com um sítio ativo específico na proteína é crítica27,44,45. As interações entre indóis ou indóis halogenados e receptores GluCL observadas neste estudo também corroboram essa noção, visto que o 5- e o 2-iodoindol se ligam aos receptores GluCL mais fortemente do que os outros indóis examinados (Figura 6 e Figura Suplementar S8). Descobriu-se que o iodo na segunda ou quinta posição do indóis se liga à leucina 218 do receptor GluCL por meio de ligações de hidrogênio na cadeia principal, enquanto outros indóis halogenados e o próprio indóis formam ligações de hidrogênio fracas na cadeia lateral com a serina 260 (Figura 6). Portanto, especulamos que a localização do halogênio desempenha um papel importante na indução da degeneração vacuolar, enquanto a forte ligação do 5-iodoindol mantém o canal iônico aberto, permitindo assim o rápido influxo de fluido e a ruptura do vacúolo. No entanto, o mecanismo de ação detalhado do 5-iodoindol ainda precisa ser determinado.
Antes da aplicação prática do 5-iodoindol, seu efeito tóxico nas plantas deve ser analisado. Nossos experimentos de germinação de sementes mostraram que o 5-iodoindol não teve efeito negativo na germinação das sementes ou nos processos de desenvolvimento subsequentes nas concentrações estudadas (Figura 7). Assim, este estudo fornece uma base para o uso do 5-iodoindol no ambiente ecológico para controlar a nocividade dos nematoides do pinheiro aos pinheiros.
Relatórios anteriores demonstraram que a terapia à base de indol representa uma abordagem potencial para abordar o problema da resistência a antibióticos e da progressão do câncer55. Além disso, os indóis possuem atividades antibacteriana, anticancerígena, antioxidante, anti-inflamatória, antidiabética, antiviral, antiproliferativa e antituberculose, e podem servir como uma base promissora para o desenvolvimento de fármacos56,57. Este estudo sugere pela primeira vez o uso potencial do iodo como agente antiparasitário e anti-helmíntico.
A avermectina foi descoberta há três décadas e ganhou o Prêmio Nobel em 2015, e seu uso como anti-helmíntico ainda está em andamento. No entanto, devido ao rápido desenvolvimento de resistência às avermectinas em nematoides e pragas de insetos, uma estratégia alternativa, de baixo custo e ecologicamente correta é necessária para controlar a infecção por NMP em pinheiros. Este estudo também relata o mecanismo pelo qual o 5-iodoindol mata os nematoides do pinheiro e que o 5-iodoindol apresenta baixa toxicidade para células vegetais, o que abre boas perspectivas para sua futura aplicação comercial.
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Yeungnam, Gyeongsan, Coreia, e os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética da Universidade Yeungnam.
Experimentos de incubação de ovos foram realizados usando procedimentos estabelecidos43. Para avaliar as taxas de eclosão (HR), nematoides adultos de 1 dia de idade (aproximadamente 100 fêmeas e 100 machos) foram transferidos para placas de Petri contendo o fungo e deixados crescer por 24 h. Os ovos foram então isolados e tratados com 5-iodoindol (0,05 mM e 0,1 mM) ou avermectina (10 μg/ml) como uma suspensão em água destilada estéril. Essas suspensões (500 μl; aproximadamente 100 ovos) foram transferidas para os poços de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços e incubadas a 22 °C. As contagens de L2 foram feitas após 24 h de incubação, mas foram consideradas mortas se as células não se movessem quando estimuladas com um fio de platina fino. Este experimento foi conduzido em duas etapas, cada uma com seis repetições. Os dados de ambos os experimentos foram combinados e apresentados. A porcentagem de HR é calculada da seguinte forma:
A mortalidade larval foi avaliada usando procedimentos previamente desenvolvidos. Os ovos de nematoides foram coletados e os embriões foram sincronizados por eclosão em água destilada estéril para gerar larvas no estágio L2. Larvas sincronizadas (aproximadamente 500 nematoides) foram tratadas com 5-iodoindol (0,05 mM e 0,1 mM) ou avermectina (10 μg/ml) e criadas em placas de Petri de B. cinerea. Após 48 h de incubação a 22 °C, os nematoides foram coletados em água destilada estéril e examinados quanto à presença dos estágios L2, L3 e L4. A presença dos estágios L3 e L4 indicou transformação larval, enquanto a presença do estágio L2 indicou nenhuma transformação. As imagens foram adquiridas usando o iRiS™ Digital Cell Imaging System. Este experimento foi conduzido em duas etapas, cada uma com seis repetições. Os dados de ambos os experimentos foram combinados e apresentados.
A toxicidade de 5-iodoindol e avermectina para sementes foi avaliada usando testes de germinação em placas de ágar Murashige e Skoog.62 As sementes de B. oleracea e R. raphanistrum foram primeiramente embebidas em água destilada estéril por um dia, lavadas com 1 ml de etanol 100%, esterilizadas com 1 ml de água sanitária comercial a 50% (hipoclorito de sódio a 3%) por 15 minutos e lavadas cinco vezes com 1 ml de água estéril. As sementes esterilizadas foram então prensadas em placas de ágar de germinação contendo 0,86 g/l (0,2X) de meio Murashige e Skoog e 0,7% de ágar bacteriológico com ou sem 5-iodoindol ou avermectina. As placas foram então incubadas a 22 °C e as imagens foram obtidas após 3 dias de incubação. Este experimento foi conduzido em duas etapas, cada uma com seis repetições.
Horário da publicação: 26 de fevereiro de 2025