O nematoide do pinheiro é um endoparasita migratório quarentenário conhecido por causar graves perdas econômicas em ecossistemas de florestas de pinheiros. O presente estudo revisa a atividade nematicida de indóis halogenados contra nematoides do pinheiro e seu mecanismo de ação. As atividades nematicidas do 5-iodoindol e da avermectina (controle positivo) contra nematoides do pinheiro foram semelhantes e elevadas em baixas concentrações (10 μg/mL). O 5-iodoindol reduziu a fecundidade, a atividade reprodutiva, a mortalidade embrionária e larval e o comportamento locomotor. As interações moleculares dos ligantes com receptores de canais de cloreto ativados por glutamato específicos de invertebrados corroboram a noção de que o 5-iodoindol, assim como a avermectina, se liga fortemente ao sítio ativo do receptor. O 5-iodoindol também induziu diversas deformações fenotípicas em nematoides, incluindo colapso/encolhimento anormal de órgãos e aumento da vacuolização. Esses resultados sugerem que os vacúolos podem desempenhar um papel na morte de nematoides mediada pela metilação. É importante ressaltar que o 5-iodoindol não foi tóxico para ambas as espécies de plantas (repolho e rabanete). Assim, este estudo demonstra que a aplicação de iodoindol em condições ambientais pode controlar os danos causados pela murcha do pinheiro.
O nematoide da madeira do pinheiro (Bursaphelenchus xylophilus) pertence à família dos nematoides da madeira do pinheiro (NMP), nematoides endoparasitas migratórios conhecidos por causarem graves danos ecológicos aos ecossistemas de florestas de pinheiros¹. A doença do murchamento do pinheiro (DMP), causada pelo nematoide da madeira do pinheiro, está se tornando um problema sério em vários continentes, incluindo Ásia e Europa, e na América do Norte, o nematoide destrói espécies de pinheiros introduzidas¹,². O declínio dos pinheiros é um grande problema econômico, e a perspectiva de sua disseminação global é preocupante³. As seguintes espécies de pinheiros são as mais comumente atacadas pelo nematoide: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis e Pinus radiata⁴. O nematoide do pinheiro é uma doença grave que pode matar pinheiros em semanas ou meses após a infecção. Além disso, surtos do nematoide do pinheiro são comuns em diversos ecossistemas, de modo que cadeias de infecção persistentes foram estabelecidas¹.
Bursaphelenchus xylophilus é um nematoide fitoparasita de quarentena pertencente à superfamília Aphelenchoidea e ao clado 102.5. O nematoide alimenta-se de fungos e reproduz-se nos tecidos lenhosos de pinheiros, desenvolvendo-se em quatro estágios larvais distintos: L1, L2, L3, L4 e adulto1,6. Em condições de escassez de alimento, o nematoide do pinheiro passa para um estágio larval especializado – dauer, que parasita seu vetor – o besouro da casca do pinheiro (Monochamus alternatus) – e é transferido para pinheiros saudáveis. Em hospedeiros saudáveis, os nematoides migram rapidamente pelos tecidos vegetais e alimentam-se das células parenquimáticas, o que leva a uma série de reações de hipersensibilidade, murchamento e morte do pinheiro em até um ano após a infecção1,7,8.
O controle biológico de nematoides do pinheiro tem sido um desafio há muito tempo, com medidas de quarentena que remontam ao século XX. As estratégias atuais para o controle de nematoides do pinheiro envolvem principalmente tratamentos químicos, incluindo a fumigação da madeira e a implantação de nematicidas nos troncos das árvores. Os nematicidas mais comumente usados são a avermectina e o benzoato de avermectina, que pertencem à família das avermectinas. Esses produtos químicos, de alto custo, são altamente eficazes contra muitas espécies de nematoides e são considerados ambientalmente seguros. No entanto, espera-se que o uso repetido desses nematicidas crie pressão seletiva que quase certamente levará ao surgimento de nematoides do pinheiro resistentes, como já foi demonstrado para diversas pragas de insetos, como Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella e os nematoides Trichostrongylus colubriformis e Ostertagia circumcincta, que desenvolveram gradualmente resistência às avermectinas. Portanto, os padrões de resistência precisam ser estudados regularmente e os nematicidas continuamente avaliados para encontrar medidas alternativas, econômicas e ambientalmente amigáveis para controlar o PVD. Nas últimas décadas, vários autores propuseram o uso de extratos de plantas, óleos essenciais e compostos voláteis como agentes de controle de nematoides13,14,15,16.
Recentemente, demonstramos a atividade nematicida do indol, uma molécula de sinalização intercelular e inter-reinos, em Caenorhabditis elegans17. O indol é um sinal intracelular amplamente utilizado na ecologia microbiana, controlando inúmeras funções que afetam a fisiologia microbiana, a formação de esporos, a estabilidade de plasmídeos, a resistência a drogas, a formação de biofilmes e a virulência18,19. A atividade do indol e seus derivados contra outros nematoides patogênicos ainda não foi estudada. Neste estudo, investigamos a atividade nematicida de 34 indóis contra nematoides do pinheiro e elucidamos o mecanismo de ação do 5-iodoindol, o mais potente, utilizando microscopia, fotografia time-lapse e experimentos de acoplamento molecular, além de avaliar seus efeitos tóxicos em plantas por meio de um ensaio de germinação de sementes.
Concentrações elevadas (>1,0 mM) de indol já foram relatadas como tendo efeito nematicida em nematoides17. Após o tratamento de B. xylophilus (estágios de vida mistos) com indol ou 33 diferentes derivados de indol a 1 mM, a mortalidade de B. xylophilus foi medida pela contagem de nematoides vivos e mortos nos grupos controle e tratados. Cinco indóis exibiram atividade nematicida significativa; a sobrevivência do grupo controle não tratado foi de 95 ± 7% após 24 h. Dos 34 indóis testados, o 5-iodoindol e o 4-fluoroindol a 1 mM causaram 100% de mortalidade, enquanto o 5,6-difluoroindigo, o metilindol-7-carboxilato e o 7-iodoindol causaram aproximadamente 50% de mortalidade (Tabela 1).
Efeito do 5-iodoindol na formação de vacúolos e no metabolismo do nematoide da madeira do pinheiro. (A) Efeito da avermectina e do 5-iodoindol em nematoides machos adultos, (B) ovos de nematoides no estágio L1 e (C) metabolismo de B. xylophilus. (i) Não foram observados vacúolos em 0 h; o tratamento resultou em (ii) vacúolos, (iii) acúmulo de múltiplos vacúolos, (iv) intumescimento dos vacúolos, (v) fusão dos vacúolos e (vi) formação de vacúolos gigantes. As setas vermelhas indicam o intumescimento dos vacúolos, as setas azuis indicam a fusão dos vacúolos e as setas pretas indicam os vacúolos gigantes. Barra de escala = 50 μm.
Além disso, este estudo também descreveu o processo sequencial de morte induzida por metano em nematoides do pinheiro (Figura 4C). A morte metanogênica é um tipo de morte celular não apoptótica associada ao acúmulo de vacúolos citoplasmáticos proeminentes27. Os defeitos morfológicos observados nos nematoides do pinheiro parecem estar intimamente relacionados ao mecanismo de morte induzida por metano. O exame microscópico em diferentes momentos mostrou que vacúolos gigantes foram formados após 20 h de exposição ao 5-iodoindol (0,1 mM). Vacúolos microscópicos foram observados após 8 h de tratamento, e seu número aumentou após 12 h. Vários vacúolos grandes foram observados após 14 h. Vários vacúolos fundidos estavam claramente visíveis após 12–16 h de tratamento, indicando que a fusão de vacúolos é a base do mecanismo de morte metanogênica. Após 20 horas, vários vacúolos gigantes foram encontrados por todo o verme. Essas observações representam o primeiro relato de metuose em C. elegans.
Em vermes tratados com 5-iodoindol, também foram observadas agregação e ruptura de vacúolos (Fig. 5), evidenciadas pela curvatura do verme e liberação do vacúolo no ambiente. A ruptura do vacúolo também foi observada na membrana da casca do ovo, que normalmente é preservada intacta pela L2 durante a eclosão (Fig. S2 suplementar). Essas observações corroboram o envolvimento do acúmulo de fluidos e da falha osmorregulatória, bem como da lesão celular reversível (LCR), no processo de formação e supuração do vacúolo (Fig. 5).
Partindo da hipótese do papel do iodo na formação de vacúolos observada, investigamos a atividade nematicida do iodeto de sódio (NaI) e do iodeto de potássio (KI). No entanto, nas concentrações testadas (0,1, 0,5 ou 1 mM), esses compostos não afetaram a sobrevivência dos nematoides nem a formação de vacúolos (Figura Suplementar S5), embora 1 mM de KI tenha apresentado um leve efeito nematicida. Por outro lado, o 7-iodoindol (1 ou 2 mM), assim como o 5-iodoindol, induziu a formação de múltiplos vacúolos e deformações estruturais (Figura Suplementar S6). Os dois iodoindóis apresentaram características fenotípicas semelhantes em nematoides do pinheiro, enquanto o NaI e o KI não. Curiosamente, o indol não induziu a formação de vacúolos em B. xylophilus nas concentrações testadas (dados não mostrados). Assim, os resultados confirmaram que o complexo indol-iodo é responsável pela vacuolização e pelo metabolismo de B. xylophilus.
Dentre os indóis testados quanto à atividade nematicida, o 5-iodoindol apresentou o maior índice de deslizamento, de -5,89 kcal/mol, seguido pelo 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) e indol (-4,03) (Figura 6). A forte ligação de hidrogênio da cadeia principal do 5-iodoindol com a leucina 218 estabiliza sua ligação, enquanto todos os outros derivados de indol se ligam à serina 260 por meio de ligações de hidrogênio da cadeia lateral. Dentre outros iodoindóis modelados, o 2-iodoindol apresenta um valor de ligação de -5,248 kcal/mol, devido à sua principal ligação de hidrogênio com a leucina 218. Outras ligações conhecidas incluem o 3-iodoindol (-4,3 kcal/mol), o 4-iodoindol (-4,0 kcal/mol) e o 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (Figura Suplementar S8). A maioria dos indóis halogenados e o próprio indol, com exceção do 5-iodoindol e do 2-iodoindol, formam uma ligação com a serina 260. O fato de a ligação de hidrogênio com a leucina 218 ser indicativa de uma ligação eficiente entre receptor e ligante, como observado para a ivermectina (Figura Suplementar S7), confirma que o 5-iodoindol e o 2-iodoindol, assim como a ivermectina, se ligam fortemente ao sítio ativo do receptor GluCL por meio da leucina 218 (Figura 6 e Figura Suplementar S8). Propomos que essa ligação seja necessária para manter a estrutura de poro aberto do complexo GluCL e que, ao se ligarem fortemente ao sítio ativo do receptor GluCL, o 5-iodoindol, o 2-iodoindol, a avermectina e a ivermectina mantenham o canal iônico aberto e permitam a captação de fluidos.
Acoplamento molecular de indol e indol halogenado à GluCL. Orientações de ligação dos ligantes (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol e (D) 5-iodoindol ao sítio ativo da GluCL. A proteína é representada por uma fita, e as ligações de hidrogênio da cadeia principal são mostradas como linhas pontilhadas amarelas. (A′), (B′), (C′) e (D′) mostram as interações dos ligantes correspondentes com os resíduos de aminoácidos circundantes, e as ligações de hidrogênio da cadeia lateral são indicadas por setas pontilhadas rosa.
Foram realizados experimentos para avaliar o efeito tóxico do 5-iodoindol na germinação de sementes de repolho e rabanete. O 5-iodoindol (0,05 ou 0,1 mM) ou a avermectina (10 μg/mL) apresentaram pouco ou nenhum efeito na germinação inicial e na emergência das plântulas (Figura 7). Além disso, não foi encontrada diferença significativa entre a taxa de germinação dos controles não tratados e as sementes tratadas com 5-iodoindol ou avermectina. O efeito no alongamento da raiz principal e no número de raízes laterais formadas foi insignificante, embora 1 mM (10 vezes a sua concentração ativa) de 5-iodoindol tenha retardado ligeiramente o desenvolvimento das raízes laterais. Esses resultados indicam que o 5-iodoindol não é tóxico para as células vegetais e não interfere nos processos de desenvolvimento das plantas nas concentrações estudadas.
Efeito do 5-iodoindol na germinação de sementes. Germinação, brotação e enraizamento lateral de sementes de B. oleracea e R. raphanistrum em meio de ágar Murashige e Skoog com ou sem avermectina ou 5-iodoindol. A germinação foi registrada após 3 dias de incubação a 22°C.
Este estudo relata diversos casos de morte de nematoides por indóis. É importante ressaltar que este é o primeiro relato de iodoindol induzindo metilação (um processo causado pelo acúmulo de pequenos vacúolos que gradualmente se fundem em vacúolos gigantes, levando eventualmente à ruptura da membrana e à morte) em agulhas de pinheiro, com o iodoindol exibindo propriedades nematicidas significativas semelhantes às do nematicida comercial avermectina.
Já foi relatado que os indóis exercem múltiplas funções de sinalização em procariontes e eucariontes, incluindo inibição/formação de biofilme, sobrevivência bacteriana e patogenicidade19,32,33,34. Recentemente, os potenciais efeitos terapêuticos de indóis halogenados, alcaloides indólicos e derivados indólicos semissintéticos têm atraído grande interesse de pesquisa35,36,37. Por exemplo, indóis halogenados demonstraram capacidade de eliminar células persistentes de Escherichia coli e Staphylococcus aureus37. Além disso, é de interesse científico estudar a eficácia de indóis halogenados contra outras espécies, gêneros e reinos, e este estudo representa um passo nessa direção.
Aqui, propomos um mecanismo para a letalidade induzida por 5-iodoindol em C. elegans baseado em lesão celular reversível (LCR) e metilação (Figuras 4C e 5). Alterações edematosas, como inchaço e degeneração vacuolar, são indicadores de LCR e metilação, manifestando-se como vacúolos gigantes no citoplasma48,49. A LCR interfere na produção de energia reduzindo a produção de ATP, causando falha na bomba de ATPase ou rompendo as membranas celulares e causando um influxo rápido de Na+, Ca2+ e água50,51,52. Vacúolos intracitoplasmáticos surgem em células animais como resultado do acúmulo de fluido no citoplasma devido ao influxo de Ca2+ e água53. Curiosamente, esse mecanismo de dano celular é reversível se o dano for temporário e as células começarem a produzir ATP por um certo período de tempo, mas se o dano persistir ou piorar, as células morrem.54 Nossas observações mostram que os nematoides tratados com 5-iodoindol são incapazes de restaurar a biossíntese normal após a exposição a condições de estresse.
O fenótipo de metilação induzido pelo 5-iodoindol em B. xylophilus pode ser devido à presença de iodo e à sua distribuição molecular, uma vez que o 7-iodoindol apresentou menor efeito inibitório sobre B. xylophilus do que o 5-iodoindol (Tabela 1 e Figura Suplementar S6). Esses resultados são parcialmente consistentes com os estudos de Maltese et al. (2014), que relataram que a translocação do grupo nitrogênio piridínico do indol da posição para para a posição meta aboliu a vacuolização, a inibição do crescimento e a citotoxicidade em células U251, sugerindo que a interação da molécula com um sítio ativo específico na proteína é crítica27,44,45. As interações entre indol ou indóis halogenados e receptores GluCL observadas neste estudo também corroboram essa noção, visto que o 5-iodoindol e o 2-iodoindol apresentaram maior afinidade de ligação aos receptores GluCL do que os demais indóis examinados (Figura 6 e Figura Suplementar S8). O iodo na segunda ou quinta posição do indol demonstrou ligar-se à leucina 218 do receptor GluCL por meio de ligações de hidrogênio na cadeia principal, enquanto outros indóis halogenados e o próprio indol formam ligações de hidrogênio fracas na cadeia lateral com a serina 260 (Figura 6). Portanto, especulamos que a localização do halogênio desempenha um papel importante na indução da degeneração vacuolar, enquanto a forte ligação do 5-iodoindol mantém o canal iônico aberto, permitindo assim um rápido influxo de fluido e a ruptura do vacúolo. Contudo, o mecanismo de ação detalhado do 5-iodoindol ainda precisa ser elucidado.
Antes da aplicação prática do 5-iodoindol, seu efeito tóxico sobre as plantas deve ser analisado. Nossos experimentos de germinação de sementes mostraram que o 5-iodoindol não teve efeito negativo sobre a germinação das sementes ou sobre os processos de desenvolvimento subsequentes nas concentrações estudadas (Figura 7). Assim, este estudo fornece uma base para o uso do 5-iodoindol no ambiente ecológico para controlar a nocividade dos nematoides do pinheiro às árvores de pinheiro.
Relatórios anteriores demonstraram que a terapia baseada em indóis representa uma abordagem potencial para lidar com o problema da resistência a antibióticos e da progressão do câncer55. Além disso, os indóis possuem atividades antibacterianas, anticancerígenas, antioxidantes, anti-inflamatórias, antidiabéticas, antivirais, antiproliferativas e antituberculosas, podendo servir como uma base promissora para o desenvolvimento de fármacos56,57. Este estudo sugere, pela primeira vez, o uso potencial do iodo como agente antiparasitário e anti-helmíntico.
A avermectina foi descoberta há três décadas e ganhou o Prêmio Nobel em 2015, sendo seu uso como anti-helmíntico ainda bastante difundido. No entanto, devido ao rápido desenvolvimento de resistência às avermectinas em nematoides e insetos-praga, uma estratégia alternativa, de baixo custo e ecologicamente correta é necessária para o controle da infecção pelo nematoide do pinheiro (PWN). Este estudo também descreve o mecanismo pelo qual o 5-iodoindol mata os nematoides do pinheiro e demonstra que o 5-iodoindol apresenta baixa toxicidade para as células vegetais, o que abre boas perspectivas para sua futura aplicação comercial.
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Yeungnam, Gyeongsan, Coreia, e os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética da Universidade de Yeungnam.
Experimentos de incubação de ovos foram realizados utilizando procedimentos estabelecidos43. Para avaliar as taxas de eclosão (TE), nematoides adultos de 1 dia de idade (aproximadamente 100 fêmeas e 100 machos) foram transferidos para placas de Petri contendo o fungo e deixados crescer por 24 h. Os ovos foram então isolados e tratados com 5-iodoindol (0,05 mM e 0,1 mM) ou avermectina (10 μg/ml) em suspensão em água destilada estéril. Essas suspensões (500 μl; aproximadamente 100 ovos) foram transferidas para os poços de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços e incubadas a 22 °C. A contagem de larvas L2 foi realizada após 24 h de incubação, sendo consideradas mortas aquelas que não se moviam ao serem estimuladas com um fio de platina fino. Este experimento foi conduzido em duas etapas, cada uma com seis repetições. Os dados de ambos os experimentos foram combinados e apresentados. A porcentagem de TE foi calculada da seguinte forma:
A mortalidade larval foi avaliada utilizando procedimentos previamente desenvolvidos. Ovos de nematóides foram coletados e os embriões foram sincronizados por eclosão em água destilada estéril para gerar larvas no estágio L2. Larvas sincronizadas (aproximadamente 500 nematóides) foram tratadas com 5-iodoindol (0,05 mM e 0,1 mM) ou avermectina (10 μg/ml) e cultivadas em placas de Petri contendo B. cinerea. Após 48 h de incubação a 22 °C, os nematóides foram coletados em água destilada estéril e examinados para a presença dos estágios L2, L3 e L4. A presença dos estágios L3 e L4 indicou transformação larval, enquanto a presença do estágio L2 indicou ausência de transformação. As imagens foram adquiridas utilizando o sistema de imagem celular digital iRiS™. Este experimento foi conduzido em duas etapas, cada uma com seis repetições. Os dados de ambos os experimentos foram combinados e apresentados.
A toxicidade do 5-iodoindol e da avermectina para sementes foi avaliada utilizando testes de germinação em placas de ágar Murashige e Skoog.⁶² Sementes de B. oleracea e R. raphanistrum foram inicialmente imersas em água destilada estéril por um dia, lavadas com 1 ml de etanol a 100%, esterilizadas com 1 ml de água sanitária comercial a 50% (3% de hipoclorito de sódio) por 15 minutos e lavadas cinco vezes com 1 ml de água estéril. As sementes esterilizadas foram então pressionadas em placas de ágar para germinação contendo 0,86 g/l (0,2X) de meio Murashige e Skoog e 0,7% de ágar bacteriológico com ou sem 5-iodoindol ou avermectina. As placas foram então incubadas a 22 °C e as imagens foram obtidas após 3 dias de incubação. Este experimento foi conduzido em duas etapas, cada uma com seis repetições.
Data da publicação: 26/02/2025