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Os fungicidas são frequentemente utilizados durante a floração de árvores frutíferas e podem ameaçar os insetos polinizadores. No entanto, pouco se sabe sobre como os polinizadores não-abelhas (por exemplo, abelhas solitárias, Osmia cornifrons) respondem aos fungicidas de contato e sistêmicos comumente usados em macieiras durante a floração. Essa lacuna de conhecimento limita as decisões regulatórias que determinam as concentrações seguras e o momento ideal para a aplicação de fungicidas. Avaliamos os efeitos de dois fungicidas de contato (captan e mancozeb) e quatro fungicidas de camada intermediária/fitosistema (ciprociclina, miclobutanil, pirostrobina e trifloxistrobina). Os efeitos foram observados no ganho de peso larval, sobrevivência, proporção sexual e diversidade bacteriana. A avaliação foi conduzida utilizando um bioensaio oral crônico, no qual o pólen foi tratado com três doses baseadas na dose atualmente recomendada para uso em campo (1X), metade da dose (0,5X) e dose baixa (0,1X). Todas as doses de mancozeb e piritionato reduziram significativamente o peso corporal e a sobrevivência larval. Em seguida, sequenciamos o gene 16S para caracterizar o bacterioma larval do mancozeb, o fungicida responsável pela maior mortalidade. Descobrimos que a diversidade e a abundância bacterianas foram significativamente reduzidas em larvas alimentadas com pólen tratado com mancozeb. Nossos resultados de laboratório indicam que a pulverização de alguns desses fungicidas durante a floração é particularmente prejudicial à saúde de O. cornifrons. Essas informações são relevantes para futuras decisões de manejo relacionadas ao uso sustentável de produtos para proteção de árvores frutíferas e servem como base para processos regulatórios voltados à proteção de polinizadores.
A abelha solitária Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) foi introduzida nos Estados Unidos, vinda do Japão, no final da década de 1970 e início da década de 1980, e desde então desempenha um importante papel de polinizadora em ecossistemas manejados. Populações naturalizadas dessa abelha fazem parte de um grupo de aproximadamente 50 espécies de abelhas selvagens que complementam as abelhas que polinizam pomares de amêndoas e maçãs nos Estados Unidos.2,3 As abelhas pedreiras enfrentam muitos desafios, incluindo fragmentação de habitat, patógenos e pesticidas.3,4 Entre os inseticidas, os fungicidas reduzem o ganho de energia, a busca por alimento e o condicionamento físico.6,7 Embora pesquisas recentes sugiram que a saúde das abelhas pedreiras seja diretamente influenciada por microrganismos comensais e ectobáticos,8,9 como bactérias e fungos podem influenciar a nutrição e as respostas imunológicas, os efeitos da exposição a fungicidas sobre a diversidade microbiana das abelhas pedreiras estão apenas começando a ser estudados.
Fungicidas de diversos efeitos (de contato e sistêmicos) são pulverizados em pomares antes e durante a floração para tratar doenças como sarna da macieira, podridão amarga, podridão parda e oídio10,11. Os fungicidas são considerados inofensivos para os polinizadores, sendo recomendados aos jardineiros durante o período de floração. A exposição e a ingestão desses fungicidas pelas abelhas são relativamente bem conhecidas, pois fazem parte do processo de registro de pesticidas pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA e muitas outras agências reguladoras nacionais12,13,14. No entanto, os efeitos dos fungicidas em organismos que não sejam abelhas são menos conhecidos, pois não são exigidos pelos acordos de autorização de comercialização nos Estados Unidos15. Além disso, geralmente não existem protocolos padronizados para testar abelhas individuais16,17, e a manutenção de colônias que forneçam abelhas para testes é um desafio18. Ensaios com diferentes espécies de abelhas manejadas estão sendo cada vez mais conduzidos na Europa e nos EUA para estudar os efeitos dos pesticidas em abelhas selvagens, e protocolos padronizados foram recentemente desenvolvidos para O. cornifrons19.
As abelhas cornudas são monócitos e são comercialmente utilizadas em cultivos de carpas como suplemento ou substituto das abelhas melíferas. Essas abelhas emergem entre março e abril, com os machos precoces emergindo três a quatro dias antes das fêmeas. Após o acasalamento, a fêmea coleta ativamente pólen e néctar para fornecer uma série de células de cria dentro da cavidade tubular do ninho (natural ou artificial)1,20. Os ovos são depositados sobre o pólen dentro das células; a fêmea então constrói uma parede de argila antes de preparar a próxima célula. As larvas do primeiro instar são envolvidas pelo córion e se alimentam de fluidos embrionários. Do segundo ao quinto instar (pré-pupa), as larvas se alimentam de pólen22. Assim que o suprimento de pólen se esgota completamente, as larvas formam casulos, pupam e emergem como adultos na mesma câmara de cria, geralmente no final do verão20,23. Os adultos emergem na primavera seguinte. A sobrevivência dos adultos está associada ao ganho líquido de energia (ganho de peso) com base na ingestão de alimentos. Assim, a qualidade nutricional do pólen, bem como outros fatores como o clima ou a exposição a pesticidas, são determinantes da sobrevivência e da saúde24.
Inseticidas e fungicidas aplicados antes da floração podem se mover dentro do sistema vascular da planta em diferentes graus, desde efeitos translaminares (por exemplo, capazes de se mover da superfície superior das folhas para a superfície inferior, como alguns fungicidas)25 até efeitos verdadeiramente sistêmicos. Alguns pesticidas, que podem penetrar na coroa a partir das raízes, podem entrar no néctar das flores da macieira26, onde podem matar adultos de O. cornifrons27. Alguns pesticidas também se infiltram no pólen, afetando o desenvolvimento das larvas do milho e causando sua morte19. Outros estudos mostraram que alguns fungicidas podem alterar significativamente o comportamento de nidificação da espécie relacionada O. lignaria28. Além disso, estudos de laboratório e de campo simulando cenários de exposição a pesticidas (incluindo fungicidas) mostraram que os pesticidas afetam negativamente a fisiologia22, a morfologia29 e a sobrevivência de abelhas melíferas e algumas abelhas solitárias. Diversas pulverizações fungicidas aplicadas diretamente em flores abertas durante a floração podem contaminar o pólen coletado pelos adultos para o desenvolvimento larval, cujos efeitos ainda precisam ser estudados30.
É cada vez mais reconhecido que o desenvolvimento larval é influenciado pelo pólen e pelas comunidades microbianas do sistema digestivo. O microbioma da abelha melífera influencia parâmetros como massa corporal31, alterações metabólicas22 e suscetibilidade a patógenos32. Estudos anteriores examinaram a influência do estágio de desenvolvimento, nutrientes e ambiente no microbioma de abelhas solitárias. Esses estudos revelaram semelhanças na estrutura e abundância dos microbiomas larval e do pólen33, bem como nos gêneros bacterianos mais comuns, Pseudomonas e Delftia, entre as espécies de abelhas solitárias. No entanto, embora os fungicidas tenham sido associados a estratégias para proteger a saúde das abelhas, os efeitos dos fungicidas na microbiota larval por meio da exposição oral direta permanecem inexplorados.
Este estudo testou os efeitos de doses reais de seis fungicidas comumente usados e registrados para uso em árvores frutíferas nos Estados Unidos, incluindo fungicidas de contato e sistêmicos administrados oralmente a larvas da mariposa-do-milho (Apis spp.) provenientes de alimentos contaminados. Constatamos que os fungicidas de contato e sistêmicos reduziram o ganho de peso corporal das abelhas e aumentaram a mortalidade, com os efeitos mais severos associados ao mancozeb e ao piritiopídeo. Em seguida, comparamos a diversidade microbiana de larvas alimentadas com dieta de pólen tratado com mancozeb com a de larvas alimentadas com dieta controle. Discutimos os mecanismos potenciais subjacentes à mortalidade e suas implicações para programas de manejo integrado de pragas e polinizadores (MIPP)36.
Abelhas adultas de O. cornifrons hibernando em casulos foram obtidas do Fruit Research Center, Biglerville, PA, e armazenadas a −3 a 2°C (±0,3°C). Antes do experimento (600 casulos no total), em maio de 2022, 100 casulos de O. cornifrons foram transferidos diariamente para copos de plástico (50 casulos por copo, com dimensões de 5 cm × 15 cm) e lenços umedecidos foram colocados dentro dos copos para promover a abertura e fornecer um substrato mastigável, reduzindo o estresse nas abelhas. Dois copos de plástico contendo os casulos foram colocados em uma gaiola para insetos (30 × 30 × 30 cm, BugDorm MegaView Science Co. Ltd., Taiwan) com alimentadores de 10 ml contendo solução de sacarose a 50% e armazenados por quatro dias para garantir o fechamento e o acasalamento. As condições foram: 23°C, umidade relativa de 60%, fotoperíodo de 10 l (baixa intensidade), durante 14 dias. Cem fêmeas e machos acasalados foram libertados todas as manhãs durante seis dias (100 por dia) em dois ninhos artificiais durante o pico da floração das macieiras (ninho-armadilha: largura 33,66 × altura 30,48 × comprimento 46,99 cm; Figura Suplementar 1). Localizada no Arboreto Estadual da Pensilvânia, perto de cerejeiras (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™), pessegueiros (Prunus persica 'Contender'), Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®), pereiras (Pyrus perifolia 'Olympic', Pyrus perifolia 'Shinko', Pyrus perifolia 'Shinseiki'), macieiras-coronarianas (Malus coronaria) e diversas variedades de macieiras (Malus coronaria, Malus), macieiras domésticas 'Co-op 30′ Enterprise™', macieiras Malus 'Co-Op 31′ Winecrisp™', begônias 'Freedom', Begonia 'Golden Delicious' e Begonia 'Nova Spy'). Cada casinha de pássaros de plástico azul se encaixa em cima de duas caixas de madeira. Cada caixa-ninho continha 800 tubos de papel kraft vazios (abertura em espiral, 0,8 cm de diâmetro interno × 15 cm de comprimento) (Jonesville Paper Tube Co., Michigan) inseridos em tubos de celofane opacos (0,7 de diâmetro externo; veja os tampões de plástico (tampões T-1X) que fornecem locais para nidificação).
Ambas as caixas-ninho estavam voltadas para o leste e cobertas com tela plástica verde para jardim (Everbilt modelo nº 889250EB12, abertura de 5 × 5 cm, 0,95 m × 100 m) para impedir o acesso de roedores e pássaros. As telas foram colocadas sobre a superfície do solo, próximas às caixas-ninho (Figura Suplementar 1a). Os ovos da broca-do-milho foram coletados diariamente, retirando-se 30 tubos dos ninhos e transportando-os para o laboratório. Com uma tesoura, fez-se um corte na extremidade do tubo e, em seguida, desmontou-se o tubo espiral para expor as células de cria. Os ovos individuais e o pólen foram removidos com uma espátula curva (Kit de lâminas para microscopia, BioQuip Products Inc., Califórnia). Os ovos foram incubados em papel de filtro umedecido e colocados em uma placa de Petri por 2 horas antes de serem utilizados nos experimentos (Figura Suplementar 1b-d).
Em laboratório, avaliamos a toxicidade oral de seis fungicidas aplicados antes e durante a floração da macieira em três concentrações (0,1X, 0,5X e 1X, onde 1X é a marca aplicada por 100 galões de água/acre. Dose alta no campo = concentração no campo) (Tabela 1). Cada concentração foi repetida 16 vezes (n = 16). Dois fungicidas de contato (Tabela S1: mancozeb 2696,14 ppm e captan 2875,88 ppm) e quatro fungicidas sistêmicos (Tabela S1: piritiostrobina 250,14 ppm; trifloxistrobina 110,06 ppm; miclobutanil azol 75,12 ppm; ciprodinil 280,845 ppm) foram avaliados quanto à toxicidade para frutas, hortaliças e plantas ornamentais. Homogeneizamos o pólen utilizando um moinho, transferimos 0,20 g para um poço (placa Falcon de 24 poços) e adicionamos e misturamos 1 μL de solução fungicida para formar pólen piramidal com poços de 1 mm de profundidade, nos quais os ovos foram colocados. A colocação foi feita com uma mini espátula (Figura Suplementar 1c,d). As placas Falcon foram armazenadas à temperatura ambiente (25 °C) e 70% de umidade relativa. Comparamos os resultados com larvas controle alimentadas com uma dieta homogênea de pólen tratada com água pura. Registramos a mortalidade e medimos o peso das larvas a cada dois dias até que atingissem a fase de pré-pupa, utilizando uma balança analítica (Fisher Scientific, precisão = 0,0001 g). Por fim, a proporção sexual foi avaliada pela abertura do casulo após 2,5 meses.
O DNA foi extraído de larvas inteiras de O. cornifrons (n = 3 por condição de tratamento, pólen tratado com mancozeb e pólen não tratado) e realizamos análises de diversidade microbiana nessas amostras, especialmente porque, no tratamento com mancozeb, a maior mortalidade foi observada nas larvas que receberam MnZn. O DNA foi amplificado, purificado utilizando o kit DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA (Zymo Research, Irvine, CA) e sequenciado (600 ciclos) em um Illumina® MiSeq™ utilizando o kit v3. O sequenciamento direcionado dos genes do RNA ribossômico 16S bacteriano foi realizado utilizando o kit Quick-16S™ NGS Library Prep (Zymo Research, Irvine, CA) com primers direcionados à região V3-V4 do gene do rRNA 16S. Adicionalmente, o sequenciamento do 18S foi realizado utilizando 10% de inclusão de PhiX, e a amplificação foi realizada utilizando o par de primers 18S001 e NS4.
Importei e processei leituras pareadas39 usando o pipeline QIIME2 (v2022.11.1). Essas leituras foram aparadas e mescladas, e as sequências quiméricas foram removidas usando o plugin DADA2 no QIIME2 (qiime dada2 noise pairing)40. As atribuições de classe de 16S e 18S foram realizadas usando o plugin de classificação de objetos Classify-sklearn e o classificador pré-treinado silva-138-99-nb-classifier.
Todos os dados experimentais foram verificados quanto à normalidade (teste de Shapiro-Wilk) e homogeneidade das variâncias (teste de Levene). Como o conjunto de dados não atendeu às premissas da análise paramétrica e a transformação não conseguiu padronizar os resíduos, realizamos uma ANOVA não paramétrica de duas vias (Kruskal-Wallis) com dois fatores [tempo (três fases: 2, 5 e 8 dias) e fungicida] para avaliar o efeito do tratamento sobre o peso fresco das larvas. Em seguida, comparações pareadas não paramétricas post hoc foram realizadas utilizando o teste de Wilcoxon. Utilizamos um modelo linear generalizado (GLM) com distribuição de Poisson para comparar os efeitos dos fungicidas sobre a sobrevivência em três concentrações de fungicida41,42. Para a análise de abundância diferencial, o número de variantes de sequência de amplicon (ASVs) foi agrupado no nível de gênero. Comparações de abundância diferencial entre grupos usando abundância relativa de 16S (nível de gênero) e 18S foram realizadas utilizando um modelo aditivo generalizado para posição, escala e forma (GAMLSS) com distribuições familiares beta inflacionadas por zeros (BEZI), modeladas em uma macro do Microbiome R43 (v1.1). 1) Remova as espécies mitocondriais e cloroplastídicas antes da análise diferencial. Devido aos diferentes níveis taxonômicos de 18S, apenas o nível mais baixo de cada táxon foi usado para as análises diferenciais. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando o R (v. 3.4.3, projeto CRAN) (Team 2013).
A exposição ao mancozeb, piritiostrobina e trifloxistrobina reduziu significativamente o ganho de peso corporal em O. cornifrons (Fig. 1). Esses efeitos foram observados consistentemente para todas as três doses avaliadas (Fig. 1a–c). A ciclostrobina e o miclobutanil não reduziram significativamente o peso das larvas.
Peso fresco médio das larvas da broca-do-caule medido em três momentos diferentes sob quatro tratamentos dietéticos (alimento homogêneo de pólen + fungicida: controle, doses 0,1X, 0,5X e 1X). (a) Dose baixa (0,1X): primeiro momento (dia 1): χ²: 30,99, gl = 6; P < 0,0001; segundo momento (dia 5): 22,83, gl = 0,0009; terceiro momento (dia 8): χ²: 28,39, gl = 6; (b) meia dose (0,5X): primeiro momento (dia 1): χ²: 35,67, gl = 6; P < 0,0001; segundo momento (dia 1): χ²: 15,98, gl = 6; P = 0,0090. terceiro ponto de tempo (dia 8) χ2: 16,47, DF = 6; (c) Local ou dose completa (1X): primeiro ponto de tempo (dia 1) χ2: 20,64, P = 6; P = 0,0326, segundo ponto de tempo (dia 5): χ2: 22,83, DF = 6; P = 0,0009; terceiro ponto de tempo (dia 8): χ2: 28,39, DF = 6; análise de variância não paramétrica. As barras representam a média ± EP das comparações aos pares (α = 0,05) (n = 16) *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001.
Na dose mais baixa (0,1X), o peso corporal das larvas foi reduzido em 60% com trifloxistrobina, 49% com mancozeb, 48% com miclobutanil e 46% com piritistrobina (Fig. 1a). Quando expostas à metade da dose de campo (0,5X), o peso corporal das larvas tratadas com mancozeb foi reduzido em 86%, com piritistrobina em 52% e com trifloxistrobina em 50% (Fig. 1b). A dose completa de campo (1X) de mancozeb reduziu o peso das larvas em 82%, com piritistrobina em 70% e com trifloxistrobina, miclobutanil e sangard em aproximadamente 30% (Fig. 1c).
A mortalidade foi maior entre as larvas alimentadas com pólen tratado com mancozeb, seguido por piritiostrobina e trifloxistrobina. A mortalidade aumentou com o aumento das doses de mancozeb e piritiosolina (Fig. 2; Tabela 2). No entanto, a mortalidade da broca-do-milho aumentou apenas ligeiramente com o aumento das concentrações de trifloxistrobina; o ciprodinil e o captan não aumentaram significativamente a mortalidade em comparação com os tratamentos de controle.
A mortalidade de larvas de moscas-da-madeira foi comparada após a ingestão de pólen tratado individualmente com seis fungicidas diferentes. Mancozeb e pentopiramida foram mais sensíveis à exposição oral de larvas de moscas-da-milho (GLM: χ² = 29,45, DF = 20, P = 0,0059) (linha, inclinação = 0,29, P < 0,001; inclinação = 0,24, P < 0,00)).
Em média, considerando todos os tratamentos, 39,05% dos pacientes eram do sexo feminino e 60,95% do sexo masculino. Entre os tratamentos de controle, a proporção de mulheres foi de 40% tanto nos estudos com baixa dose (0,1X) quanto com metade da dose (0,5X), e de 30% nos estudos com dose de campo (1X). Na dose de 0,1X, entre as larvas alimentadas com pólen e tratadas com mancozeb e miclobutanil, 33,33% dos adultos eram fêmeas, 22% dos adultos eram fêmeas, 44% das larvas adultas eram fêmeas, 44% das larvas adultas eram fêmeas, 41% das larvas adultas eram fêmeas e, no grupo controle, 31% (Fig. 3a). Com 0,5 vezes a dose, 33% dos vermes adultos no grupo mancozeb e piritiostrobina eram fêmeas, 36% no grupo trifloxistrobina, 41% no grupo miclobutanil e 46% no grupo ciprostrobina. Esse percentual foi de 53% no grupo captan e 38% no grupo controle (Fig. 3b). Com 1X a dose, 30% dos vermes no grupo mancozeb eram fêmeas, 36% no grupo piritiostrobina, 44% no grupo trifloxistrobina, 38% no grupo miclobutanil e 50% no grupo controle eram fêmeas – 38,5% no grupo controle (Fig. 3c).
Percentagem de larvas fêmeas e machos após exposição ao fungicida na fase larval. (a) Dose baixa (0,1X). (b) Meia dose (0,5X). (c) Dose de campo ou dose completa (1X).
A análise da sequência 16S mostrou que o grupo bacteriano diferiu entre as larvas alimentadas com pólen tratado com mancozeb e as larvas alimentadas com pólen não tratado (Fig. 4a). O índice microbiano das larvas não tratadas alimentadas com pólen foi maior do que o das larvas alimentadas com pólen tratado com mancozeb (Fig. 4b). Embora a diferença observada na riqueza entre os grupos não tenha sido estatisticamente significativa, foi significativamente menor do que a observada para as larvas alimentadas com pólen não tratado (Fig. 4c). A abundância relativa mostrou que a microbiota das larvas alimentadas com pólen controle era mais diversa do que a das larvas alimentadas com pólen tratado com mancozeb (Fig. 5a). A análise descritiva revelou a presença de 28 gêneros nas amostras controle e tratadas com mancozeb (Fig. 5b). A análise utilizando o sequenciamento 18S não revelou diferenças significativas (Figura Suplementar 2).
Os perfis de SAV baseados em sequências 16S foram comparados com a riqueza de Shannon e a riqueza observada em nível de filo. (a) Análise de coordenadas principais (PCoA) baseada na estrutura geral da comunidade microbiana em larvas alimentadas com pólen não tratado ou controle (azul) e larvas alimentadas com mancozeb (laranja). Cada ponto de dados representa uma amostra separada. A PCoA foi calculada usando a distância de Bray-Curtis da distribuição t multivariada. Os ovais representam o nível de confiança de 80%. (b) Diagrama de caixa, dados brutos de riqueza de Shannon (pontos) e (c) riqueza observável. Os diagramas de caixa mostram caixas para a linha mediana, intervalo interquartil (IQR) e 1,5 × IQR (n = 3).
Composição das comunidades microbianas de larvas alimentadas com pólen tratado e não tratado com mancozeb. (a) Abundância relativa de gêneros microbianos em larvas. (b) Mapa de calor das comunidades microbianas identificadas. Delftia (razão de chances (OR) = 0,67, P = 0,0030) e Pseudomonas (OR = 0,3, P = 0,0074), Microbacterium (OR = 0,75, P = 0,0617) (OR = 1,5, P = 0,0060); as linhas do mapa de calor foram agrupadas usando a distância de correlação e a conectividade média.
Nossos resultados mostram que a exposição oral a fungicidas de contato (mancozeb) e sistêmicos (pirostrobina e trifloxistrobina), amplamente aplicados durante a floração, reduziu significativamente o ganho de peso e aumentou a mortalidade de larvas de milho. Além disso, o mancozeb reduziu significativamente a diversidade e a riqueza do microbioma durante o estágio de pré-pupa. O miclobutanil, outro fungicida sistêmico, reduziu significativamente o ganho de peso das larvas em todas as três doses. Esse efeito foi evidente no segundo (dia 5) e terceiro (dia 8) momentos de avaliação. Em contraste, o ciprodinil e o captan não reduziram significativamente o ganho de peso ou a sobrevivência em comparação com o grupo controle. Até onde sabemos, este trabalho é o primeiro a determinar os efeitos de doses de campo de diferentes fungicidas usados para proteger as lavouras de milho por meio da exposição direta ao pólen.
Todos os tratamentos com fungicidas reduziram significativamente o ganho de peso corporal em comparação com os tratamentos de controle. O mancozeb teve o maior efeito no ganho de peso das larvas, com uma redução média de 51%, seguido pela piritiostrobina. No entanto, outros estudos não relataram efeitos adversos de doses de fungicidas aplicadas em campo sobre os estágios larvais44. Embora os biocidas ditiocarbamatos tenham demonstrado baixa toxicidade aguda45, os bisditiocarbamatos de etileno (EBDCS), como o mancozeb, podem se degradar em sulfeto de etileno-ureia. Dados os seus efeitos mutagênicos em outros animais, esse produto de degradação pode ser responsável pelos efeitos observados46,47. Estudos anteriores mostraram que a formação de etilenotioureia é influenciada por fatores como temperatura elevada48, níveis de umidade49 e tempo de armazenamento do produto50. Condições adequadas de armazenamento de biocidas podem mitigar esses efeitos colaterais. Além disso, a Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos expressou preocupação com a toxicidade do piritiopídeo, que demonstrou ser carcinogênico para o sistema digestivo de outros animais51.
A administração oral de mancozeb, piritiostrobina e trifloxistrobina aumenta a mortalidade de larvas da broca-do-milho. Em contraste, miclobutanil, ciprociclina e captan não apresentaram efeito sobre a mortalidade. Esses resultados diferem dos de Ladurner et al.⁵², que demonstraram que o captan reduziu significativamente a sobrevivência de adultos de O. lignaria e Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apisidae). Além disso, fungicidas como captan e boscalida podem causar mortalidade larval⁵²,⁵³,⁵⁴ ou alterar o comportamento alimentar⁵⁵. Essas alterações, por sua vez, podem afetar a qualidade nutricional do pólen e, consequentemente, o ganho energético da fase larval. A mortalidade observada no grupo controle foi consistente com outros estudos⁵⁶,⁵⁷.
A proporção sexual favorável aos machos observada em nosso trabalho pode ser explicada por fatores como acasalamento insuficiente e condições climáticas adversas durante a floração, como sugerido anteriormente para O. cornuta por Vicens e Bosch. Embora fêmeas e machos em nosso estudo tivessem quatro dias para acasalar (um período geralmente considerado suficiente para o sucesso do acasalamento), reduzimos deliberadamente a intensidade da luz para minimizar o estresse. No entanto, essa modificação pode interferir involuntariamente no processo de acasalamento61. Além disso, as abelhas enfrentam vários dias de clima adverso, incluindo chuva e baixas temperaturas (<5°C), o que também pode impactar negativamente o sucesso do acasalamento4,23.
Embora nosso estudo tenha se concentrado no microbioma larval completo, nossos resultados fornecem informações sobre possíveis relações entre comunidades bacterianas que podem ser cruciais para a nutrição das abelhas e a exposição a fungicidas. Por exemplo, larvas alimentadas com pólen tratado com mancozeb apresentaram estrutura e abundância da comunidade microbiana significativamente reduzidas em comparação com larvas alimentadas com pólen não tratado. Nas larvas que consumiram pólen não tratado, os grupos bacterianos Proteobacteria e Actinobacteria foram dominantes e predominantemente aeróbios ou facultativamente aeróbios. As bactérias de Delft, geralmente associadas a espécies de abelhas solitárias, são conhecidas por apresentarem atividade antibiótica, indicando um potencial papel protetor contra patógenos. Outra espécie bacteriana, Pseudomonas, foi abundante em larvas alimentadas com pólen não tratado, mas apresentou redução significativa em larvas tratadas com mancozeb. Nossos resultados corroboram estudos anteriores que identificaram Pseudomonas como um dos gêneros mais abundantes em O. bicornis35 e outras vespas solitárias34. Embora a evidência experimental do papel da Pseudomonas na saúde de O. cornifrons não tenha sido estudada, foi demonstrado que essa bactéria promove a síntese de toxinas protetoras no besouro Paederus fuscipes e promove o metabolismo da arginina in vitro 35, 65. Essas observações sugerem um papel potencial na defesa viral e bacteriana durante o desenvolvimento das larvas de O. cornifrons. Microbacterium é outro gênero identificado em nosso estudo que, segundo relatos, está presente em grande número em larvas da mosca-soldado-negra em condições de inanição 66. Em larvas de O. cornifrons, as microbactérias podem contribuir para o equilíbrio e a resiliência do microbioma intestinal em condições de estresse. Além disso, Rhodococcus é encontrado em larvas de O. cornifrons e é conhecido por suas capacidades de desintoxicação 67. Esse gênero também é encontrado no intestino de A. florea, mas em baixíssima abundância 68. Nossos resultados demonstram a presença de múltiplas variações genéticas em diversos táxons microbianos que podem alterar os processos metabólicos em larvas. No entanto, é necessário um melhor entendimento da diversidade funcional de O. cornifrons.
Em resumo, os resultados indicam que o mancozeb, a piritiostrobina e a trifloxistrobina reduziram o ganho de peso corporal e aumentaram a mortalidade das larvas da broca-do-milho. Embora haja uma crescente preocupação com os efeitos dos fungicidas sobre os polinizadores, é necessário compreender melhor os efeitos dos metabólitos residuais desses compostos. Esses resultados podem ser incorporados em recomendações para programas de manejo integrado de polinizadores que auxiliem os agricultores a evitar o uso de certos fungicidas antes e durante a floração das árvores frutíferas, selecionando os fungicidas e variando o momento da aplicação, ou incentivando o uso de alternativas menos nocivas. Essa informação é importante para o desenvolvimento de recomendações sobre o uso de pesticidas, como o ajuste de programas de pulverização existentes e a alteração do momento da aplicação ao selecionar fungicidas ou promover o uso de alternativas menos perigosas. Mais pesquisas são necessárias sobre os efeitos adversos dos fungicidas na proporção sexual, no comportamento alimentar, no microbioma intestinal e nos mecanismos moleculares subjacentes à perda de peso e à mortalidade da broca-do-milho.
Os dados de origem 1, 2 e 3 nas Figuras 1 e 2 foram depositados no repositório de dados figshare DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 e https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. As sequências analisadas no presente estudo (Figs. 4, 5) estão disponíveis no repositório NCBI SRA sob o número de acesso PRJNA1023565.
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Data da publicação: 14 de maio de 2024