A distribuição sazonal da precipitação na província de Guizhou é desigual, com maior precipitação na primavera e no verão, mas as mudas de colza são suscetíveis ao estresse hídrico no outono e no inverno, o que afeta seriamente o rendimento. A mostarda é uma oleaginosa especial cultivada principalmente na província de Guizhou. Ela tem forte tolerância à seca e pode ser cultivada em áreas montanhosas. É um rico recurso de genes resistentes à seca. A descoberta de genes resistentes à seca é de importância crítica para o melhoramento de variedades de mostarda e inovação em recursos de germoplasma. A família GRF desempenha um papel crítico no crescimento e desenvolvimento das plantas e na resposta ao estresse hídrico. Atualmente, os genes GRF foram encontrados em Arabidopsis 2, arroz (Oryza sativa) 12, colza 13, algodão (Gossypium hirsutum) 14, trigo (Triticum aestivum) 15, milheto perolado (Setaria italica) 16 e Brassica 17, mas não há relatos de genes GRF detectados em mostarda. Neste estudo, os genes da família GRF da mostarda foram identificados em nível genômico, e suas características físicas e químicas, relações evolutivas, homologia, motivos conservados, estrutura gênica, duplicações gênicas, elementos cis e estágio de plântula (estágio de quatro folhas) foram analisados. Os padrões de expressão sob estresse hídrico foram analisados de forma abrangente para fornecer uma base científica para estudos futuros sobre a função potencial dos genes BjGRF na resposta à seca e para fornecer genes candidatos para o melhoramento de mostarda tolerante à seca.
Trinta e quatro genes BjGRF foram identificados no genoma de Brassica juncea usando duas buscas HMMER, todas contendo os domínios QLQ e WRC. As sequências CDS dos genes BjGRF identificados são apresentadas na Tabela Suplementar S1. BjGRF01–BjGRF34 são nomeados com base em sua localização no cromossomo. As propriedades físico-químicas desta família indicam que o comprimento dos aminoácidos é altamente variável, variando de 261 aa (BjGRF19) a 905 aa (BjGRF28). O ponto isoelétrico de BjGRF varia de 6,19 (BjGRF02) a 9,35 (BjGRF03), com uma média de 8,33, e 88,24% de BjGRF é uma proteína básica. A faixa de peso molecular prevista de BjGRF é de 29,82 kDa (BjGRF19) a 102,90 kDa (BjGRF28); o índice de instabilidade das proteínas BjGRF varia de 51,13 (BjGRF08) a 78,24 (BjGRF19), todos são maiores que 40, indicando que o índice de ácidos graxos varia de 43,65 (BjGRF01) a 78,78 (BjGRF22), a hidrofilicidade média (GRAVY) varia de -1,07 (BjGRF31) a -0,45 (BjGRF22), todas as proteínas BjGRF hidrofílicas têm valores GRAVY negativos, o que pode ser devido à falta de hidrofobicidade causada pelos resíduos. A previsão da localização subcelular mostrou que 31 proteínas codificadas por BjGRF poderiam ser localizadas no núcleo, BjGRF04 poderia ser localizada em peroxissomos, BjGRF25 poderia ser localizada no citoplasma e BjGRF28 poderia ser localizada em cloroplastos (Tabela 1), indicando que BjGRFs podem ser localizados no núcleo e desempenhar um importante papel regulador como um fator de transcrição.
A análise filogenética de famílias de GRF em diferentes espécies pode auxiliar no estudo das funções genéticas. Portanto, as sequências completas de aminoácidos de 35 GRFs de colza, 16 de nabo, 12 de arroz, 10 de milheto e 9 de Arabidopsis foram baixadas e uma árvore filogenética foi construída com base em 34 genes BjGRF identificados (Fig. 1). As três subfamílias contêm diferentes números de membros; 116 TFs de GRF são divididos em três subfamílias diferentes (grupos A~C), contendo 59 (50,86%), 34 (29,31%) e 23 (19,83)% dos GRFs, respectivamente. Entre eles, 34 membros da família BjGRF estão espalhados em 3 subfamílias: 13 membros no grupo A (38,24%), 12 membros no grupo B (35,29%) e 9 membros no grupo C (26,47%). No processo de poliploidização da mostarda, o número de genes BjGRFs em diferentes subfamílias é diferente, e amplificação e perda de genes podem ter ocorrido. Vale ressaltar que não há distribuição de GRFs de arroz e milheto no grupo C, enquanto há 2 GRFs de arroz e 1 GRF de milheto no grupo B, e a maioria dos GRFs de arroz e milheto está agrupada em um único ramo, indicando que os BjGRFs estão intimamente relacionados às dicotiledôneas. Entre eles, os estudos mais aprofundados sobre a função de GRF em Arabidopsis thaliana fornecem uma base para estudos funcionais de BjGRFs.
Árvore filogenética da mostarda, incluindo Brassica napus, Brassica napus, arroz, milheto e membros da família Arabidopsis thaliana GRF.
Análise de genes repetitivos na família GRF da mostarda. A linha cinza ao fundo representa um bloco sincronizado no genoma da mostarda, a linha vermelha representa um par de repetições segmentadas do gene BjGRF;
Expressão do gene BjGRF sob estresse hídrico no estágio de quarta folha. Os dados de qRT-PCR são mostrados na Tabela Suplementar S5. As diferenças significativas nos dados são indicadas por letras minúsculas.
À medida que o clima global continua a mudar, estudar como as culturas lidam com o estresse hídrico e melhorar seus mecanismos de tolerância tornou-se um tópico de pesquisa em alta18. Após a seca, a estrutura morfológica, a expressão gênica e os processos metabólicos das plantas mudam, o que pode levar à cessação da fotossíntese e a distúrbios metabólicos, afetando o rendimento e a qualidade das culturas19,20,21. Quando as plantas percebem os sinais de seca, elas produzem segundos mensageiros, como Ca2+ e fosfatidilinositol, aumentam a concentração intracelular de íons cálcio e ativam a rede reguladora da via de fosforilação de proteínas22,23. A proteína alvo final está diretamente envolvida na defesa celular ou regula a expressão de genes de estresse relacionados por meio de TFs, aumentando a tolerância da planta ao estresse24,25. Assim, os TFs desempenham um papel crucial na resposta ao estresse hídrico. De acordo com a sequência e as propriedades de ligação ao DNA dos TFs responsivos ao estresse hídrico, os TFs podem ser divididos em diferentes famílias, como GRF, ERF, MYB, WRKY e outras famílias26.
A família de genes GRF é um tipo de TF específico de planta que desempenha papéis importantes em vários aspectos, como crescimento, desenvolvimento, transdução de sinal e respostas de defesa da planta27. Desde que o primeiro gene GRF foi identificado em O. sativa28, mais e mais genes GRF foram identificados em muitas espécies e demonstraram afetar o crescimento, o desenvolvimento e a resposta ao estresse da planta8, 29, 30,31,32. Com a publicação da sequência do genoma da Brassica juncea, a identificação da família de genes BjGRF tornou-se possível33. Neste estudo, 34 genes BjGRF foram identificados em todo o genoma da mostarda e denominados BjGRF01–BjGRF34 com base em sua posição cromossômica. Todos eles contêm domínios QLQ e WRC altamente conservados. A análise das propriedades físico-químicas mostrou que as diferenças nos números de aminoácidos e pesos moleculares das proteínas BjGRF (exceto BjGRF28) não foram significativas, indicando que os membros da família BjGRF podem ter funções semelhantes. A análise da estrutura genética mostrou que 64,7% dos genes BjGRF continham 4 éxons, indicando que a estrutura do gene BjGRF é relativamente conservada na evolução, mas o número de éxons nos genes BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 e BjGRF29 é maior. Estudos demonstraram que a adição ou deleção de éxons ou íntrons pode levar a diferenças na estrutura e função do gene, criando assim novos genes34,35,36. Portanto, especulamos que o íntron de BjGRF foi perdido durante a evolução, o que pode causar alterações na função do gene. Consistente com estudos existentes, também descobrimos que o número de íntrons estava associado à expressão gênica. Quando o número de íntrons em um gene é grande, o gene pode responder rapidamente a vários fatores desfavoráveis.
A duplicação genética é um fator importante na evolução genômica e genética37. Estudos relacionados mostraram que a duplicação genética não apenas aumenta o número de genes GRF, mas também serve como um meio de gerar novos genes para ajudar as plantas a se adaptarem a várias condições ambientais adversas38. Um total de 48 pares de genes duplicados foram encontrados neste estudo, todos os quais eram duplicações segmentares, indicando que as duplicações segmentares são o principal mecanismo para aumentar o número de genes nesta família. Foi relatado na literatura que a duplicação segmentar pode efetivamente promover a amplificação de membros da família de genes GRF em Arabidopsis e morango, e nenhuma duplicação em tandem desta família de genes foi encontrada em nenhuma das espécies27,39. Os resultados deste estudo são consistentes com estudos existentes sobre as famílias Arabidopsis thaliana e morango, sugerindo que a família GRF pode aumentar o número de genes e gerar novos genes por meio da duplicação segmentar em diferentes plantas.
Neste estudo, um total de 34 genes BjGRF foram identificados em mostarda, que foram divididos em 3 subfamílias. Esses genes apresentaram motivos conservados e estruturas gênicas semelhantes. A análise de colinearidade revelou 48 pares de duplicações de segmentos em mostarda. A região promotora de BjGRF contém elementos cis-atuantes associados à resposta à luz, resposta hormonal, resposta ao estresse ambiental e crescimento e desenvolvimento. A expressão de 34 genes BjGRF foi detectada no estágio de muda de mostarda (raízes, caules, folhas) e o padrão de expressão de 10 genes BjGRF sob condições de seca. Foi descoberto que os padrões de expressão dos genes BjGRF sob estresse de seca foram semelhantes e podem ser semelhantes. envolvimento na regulação forçada pela seca. Os genes BjGRF03 e BjGRF32 podem desempenhar papéis regulatórios positivos no estresse de seca, enquanto BjGRF06 e BjGRF23 desempenham papéis no estresse de seca como genes alvo do miR396. No geral, nosso estudo fornece uma base biológica para futuras descobertas da função do gene BjGRF em plantas Brassicaceae.
As sementes de mostarda utilizadas neste experimento foram fornecidas pelo Instituto de Pesquisa de Sementes Oleaginosas de Guizhou, da Academia de Ciências Agrícolas de Guizhou. Selecione as sementes inteiras e plante-as em solo (substrato: solo = 3:1) e colete as raízes, caules e folhas após o estágio de quatro folhas. As plantas foram tratadas com 20% de PEG 6000 para simular a seca, e as folhas foram coletadas após 0, 3, 6, 12 e 24 horas. Todas as amostras de plantas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em um freezer a -80 °C para o próximo teste.
Todos os dados obtidos ou analisados durante este estudo estão incluídos no artigo publicado e nos arquivos de informações suplementares.
Horário da publicação: 22/01/2025