A distribuição sazonal da precipitação na província de Guizhou é irregular, com maior precipitação na primavera e no verão, mas as mudas de colza são suscetíveis ao estresse hídrico no outono e inverno, o que afeta seriamente a produtividade. A mostarda é uma oleaginosa especial cultivada principalmente na província de Guizhou. Possui forte tolerância à seca e pode ser cultivada em áreas montanhosas. É uma rica fonte de genes resistentes à seca. A descoberta desses genes é de importância crucial para o melhoramento de variedades de mostarda e para a inovação em recursos de germoplasma. A família GRF desempenha um papel fundamental no crescimento e desenvolvimento das plantas e na resposta ao estresse hídrico. Atualmente, genes GRF foram encontrados em Arabidopsis 2, arroz (Oryza sativa) 12, colza 13, algodão (Gossypium hirsutum) 14, trigo (Triticum aestivum) 15, milheto (Setaria italica) 16 e Brassica 17, mas não há relatos de genes GRF detectados em mostarda. Neste estudo, os genes da família GRF da mostarda foram identificados em nível genômico e suas características físico-químicas, relações evolutivas, homologia, motivos conservados, estrutura gênica, duplicações gênicas, elementos cis e estágio de plântula (estágio de quatro folhas) foram analisados. Os padrões de expressão sob estresse hídrico foram analisados de forma abrangente para fornecer uma base científica para estudos futuros sobre a função potencial dos genes BjGRF na resposta à seca e para fornecer genes candidatos para o melhoramento de mostarda tolerante à seca.
Trinta e quatro genes BjGRF foram identificados no genoma de Brassica juncea usando duas buscas com o HMMER, todos contendo os domínios QLQ e WRC. As sequências de CDS dos genes BjGRF identificados são apresentadas na Tabela Suplementar S1. Os genes BjGRF01 a BjGRF34 são nomeados com base em sua localização no cromossomo. As propriedades físico-químicas dessa família indicam que o comprimento da cadeia de aminoácidos é altamente variável, variando de 261 aa (BjGRF19) a 905 aa (BjGRF28). O ponto isoelétrico do BjGRF varia de 6,19 (BjGRF02) a 9,35 (BjGRF03), com uma média de 8,33, e 88,24% do BjGRF é uma proteína básica. A faixa de peso molecular prevista para BjGRF é de 29,82 kDa (BjGRF19) a 102,90 kDa (BjGRF28); o índice de instabilidade das proteínas BjGRF varia de 51,13 (BjGRF08) a 78,24 (BjGRF19), todos maiores que 40, indicando que o índice de ácidos graxos varia de 43,65 (BjGRF01) a 78,78 (BjGRF22), a hidrofilicidade média (GRAVY) varia de -1,07 (BjGRF31) a -0,45 (BjGRF22), todas as proteínas BjGRF hidrofílicas têm valores GRAVY negativos, o que pode ser devido à falta de hidrofobicidade causada pelos resíduos. A previsão de localização subcelular mostrou que 31 proteínas codificadas por BjGRF poderiam ser localizadas no núcleo, BjGRF04 poderia ser localizada em peroxissomos, BjGRF25 poderia ser localizada no citoplasma e BjGRF28 poderia ser localizada em cloroplastos (Tabela 1), indicando que os BjGRFs podem estar localizados no núcleo e desempenhar um importante papel regulatório como fator de transcrição.
A análise filogenética de famílias de GRFs em diferentes espécies pode auxiliar no estudo das funções gênicas. Portanto, as sequências completas de aminoácidos de 35 GRFs de canola, 16 de nabo, 12 de arroz, 10 de painço e 9 de Arabidopsis foram baixadas e uma árvore filogenética foi construída com base em 34 genes BjGRF identificados (Fig. 1). As três subfamílias contêm números diferentes de membros; 116 fatores de transcrição GRF são divididos em três subfamílias diferentes (grupos A a C), contendo 59% (50,86%), 34% (29,31%) e 23% (19,83%) dos GRFs, respectivamente. Dentre eles, 34 membros da família BjGRF estão distribuídos em 3 subfamílias: 13 membros no grupo A (38,24%), 12 membros no grupo B (35,29%) e 9 membros no grupo C (26,47%). No processo de poliploidização da mostarda, o número de genes BjGRF em diferentes subfamílias varia, podendo ter ocorrido amplificação e perda gênica. Vale ressaltar que não há distribuição de GRFs de arroz e milheto no grupo C, enquanto há 2 GRFs de arroz e 1 de milheto no grupo B, e a maioria dos GRFs de arroz e milheto está agrupada em um mesmo ramo, indicando que os BjGRFs estão intimamente relacionados às dicotiledôneas. Dentre eles, os estudos mais aprofundados sobre a função dos GRFs em Arabidopsis thaliana fornecem uma base para estudos funcionais dos BjGRFs.
Árvore filogenética da mostarda, incluindo Brassica napus, arroz, painço e membros da família GRF de Arabidopsis thaliana.
Análise de genes repetitivos na família GRF da mostarda. A linha cinza ao fundo representa um bloco sincronizado no genoma da mostarda, a linha vermelha representa um par de repetições segmentadas do gene BjGRF;
Expressão do gene BjGRF sob estresse hídrico no quarto estágio foliar. Os dados de qRT-PCR são apresentados na Tabela Suplementar S5. Diferenças significativas nos dados são indicadas por letras minúsculas.
Com as mudanças climáticas globais em curso, o estudo de como as culturas lidam com o estresse hídrico e o aprimoramento de seus mecanismos de tolerância tornaram-se temas de pesquisa importantes18. Após a seca, a estrutura morfológica, a expressão gênica e os processos metabólicos das plantas sofrem alterações, o que pode levar à interrupção da fotossíntese e a distúrbios metabólicos, afetando a produtividade e a qualidade das culturas19,20,21. Quando as plantas percebem os sinais de seca, produzem segundos mensageiros, como Ca2+ e fosfatidilinositol, aumentam a concentração intracelular de íons de cálcio e ativam a rede regulatória da via de fosforilação de proteínas22,23. A proteína-alvo final está diretamente envolvida na defesa celular ou regula a expressão de genes relacionados ao estresse por meio de fatores de transcrição (FTs), aumentando a tolerância da planta ao estresse24,25. Assim, os FTs desempenham um papel crucial na resposta ao estresse hídrico. De acordo com a sequência e as propriedades de ligação ao DNA dos FTs responsivos ao estresse hídrico, estes podem ser divididos em diferentes famílias, como GRF, ERF, MYB, WRKY e outras26.
A família de genes GRF é um tipo de fator de transcrição (FT) específico de plantas que desempenha papéis importantes em vários aspectos, como crescimento, desenvolvimento, transdução de sinal e respostas de defesa vegetal27. Desde a identificação do primeiro gene GRF em *Oryza sativa*28, mais e mais genes GRF foram identificados em diversas espécies e demonstraram afetar o crescimento, o desenvolvimento e a resposta ao estresse das plantas8, 29, 30, 31, 32. Com a publicação da sequência do genoma de *Brassica juncea*, a identificação da família de genes BjGRF tornou-se possível33. Neste estudo, 34 genes BjGRF foram identificados em todo o genoma da mostarda e denominados BjGRF01–BjGRF34 com base em sua posição cromossômica. Todos eles contêm domínios QLQ e WRC altamente conservados. A análise das propriedades físico-químicas mostrou que as diferenças no número de aminoácidos e nos pesos moleculares das proteínas BjGRF (exceto BjGRF28) não foram significativas, indicando que os membros da família BjGRF podem ter funções semelhantes. A análise da estrutura gênica mostrou que 64,7% dos genes BjGRF continham 4 exons, indicando que a estrutura do gene BjGRF é relativamente conservada na evolução, mas o número de exons nos genes BjGRF10, BjGRF16, BjGRF28 e BjGRF29 é maior. Estudos demonstraram que a adição ou deleção de exons ou introns pode levar a diferenças na estrutura e função gênica, criando assim novos genes34,35,36. Portanto, especulamos que o intron do BjGRF foi perdido durante a evolução, o que pode causar alterações na função do gene. Em consonância com estudos existentes, também descobrimos que o número de introns estava associado à expressão gênica. Quando o número de introns em um gene é grande, o gene pode responder rapidamente a vários fatores desfavoráveis.
A duplicação gênica é um fator importante na evolução genômica e genética37. Estudos relacionados mostraram que a duplicação gênica não apenas aumenta o número de genes GRF, mas também serve como um meio de gerar novos genes para ajudar as plantas a se adaptarem a diversas condições ambientais adversas38. Um total de 48 pares de genes duplicados foram encontrados neste estudo, todos duplicações segmentares, indicando que as duplicações segmentares são o principal mecanismo para aumentar o número de genes nessa família. Foi relatado na literatura que a duplicação segmentar pode promover efetivamente a amplificação de membros da família de genes GRF em Arabidopsis e morango, e nenhuma duplicação em tandem dessa família de genes foi encontrada em nenhuma das espécies27,39. Os resultados deste estudo são consistentes com estudos existentes sobre as famílias de Arabidopsis thaliana e morango, sugerindo que a família GRF pode aumentar o número de genes e gerar novos genes por meio de duplicação segmentar em diferentes plantas.
Neste estudo, um total de 34 genes BjGRF foram identificados em mostarda, os quais foram divididos em 3 subfamílias. Esses genes apresentaram motivos conservados e estruturas gênicas semelhantes. A análise de colinearidade revelou 48 pares de duplicações de segmentos em mostarda. A região promotora de BjGRF contém elementos cis-regulatórios associados à resposta à luz, resposta hormonal, resposta ao estresse ambiental e crescimento e desenvolvimento. A expressão dos 34 genes BjGRF foi detectada no estágio de plântula de mostarda (raízes, caules e folhas), e o padrão de expressão de 10 genes BjGRF foi analisado sob condições de seca. Observou-se que os padrões de expressão dos genes BjGRF sob estresse hídrico foram semelhantes e podem estar envolvidos na regulação da resposta à seca. Os genes BjGRF03 e BjGRF32 podem desempenhar papéis regulatórios positivos no estresse hídrico, enquanto BjGRF06 e BjGRF23 atuam como genes-alvo do miR396. Em geral, nosso estudo fornece uma base biológica para futuras descobertas sobre a função do gene BjGRF em plantas da família Brassicaceae.
As sementes de mostarda utilizadas neste experimento foram fornecidas pelo Instituto de Pesquisa de Oleaginosas de Guizhou, Academia de Ciências Agrícolas de Guizhou. As sementes inteiras foram selecionadas e plantadas em solo (substrato: solo = 3:1), e as raízes, caules e folhas foram coletados após o estágio de quatro folhas. As plantas foram tratadas com PEG 6000 a 20% para simular a seca, e as folhas foram coletadas após 0, 3, 6, 12 e 24 horas. Todas as amostras de plantas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em freezer a -80°C para testes posteriores.
Todos os dados obtidos ou analisados durante este estudo estão incluídos no artigo publicado e nos arquivos de informações suplementares.
Data da publicação: 22 de janeiro de 2025