Este estudo avaliou a letalidade, subletalidade e toxicidade de produtos comerciais.cipermetrinaformulações para girinos de anuros. No teste agudo, concentrações de 100 a 800 μg/L foram testadas por 96 horas. No teste crônico, concentrações de cipermetrina naturalmente presentes (1, 3, 6 e 20 μg/L) foram testadas quanto à mortalidade, seguidas por testes de micronúcleos e anormalidades nucleares em eritrócitos por 7 dias. A CL50 da formulação comercial de cipermetrina para girinos foi de 273,41 μg L−1. No teste crônico, a maior concentração (20 μg L−1) resultou em mortalidade superior a 50%, matando metade dos girinos testados. O teste de micronúcleos apresentou resultados significativos em 6 e 20 μg L−1 e diversas anormalidades nucleares foram detectadas, indicando que a formulação comercial de cipermetrina possui potencial genotóxico contra P. gracilis. A cipermetrina representa um alto risco para esta espécie, indicando que pode causar múltiplos problemas e afetar a dinâmica deste ecossistema a curto e longo prazo. Portanto, pode-se concluir que as formulações comerciais de cipermetrina têm efeitos tóxicos sobre P. gracilis.
Devido à expansão contínua das atividades agrícolas e à aplicação intensiva decontrole de pragasmedidas, animais aquáticos são frequentemente expostos a pesticidas1,2. A poluição dos recursos hídricos perto de campos agrícolas pode afetar o desenvolvimento e a sobrevivência de organismos não-alvo, como anfíbios.
Os anfíbios estão se tornando cada vez mais importantes na avaliação de matrizes ambientais. Os anuros são considerados bons bioindicadores de poluentes ambientais devido às suas características únicas, como ciclos de vida complexos, altas taxas de crescimento larval, status trófico, pele permeável10,11, dependência da água para reprodução12 e ovos desprotegidos11,13,14. A rã-d'água-pequena (Physalaemus gracilis), comumente conhecida como rã-chorona, tem se mostrado uma espécie bioindicadora de poluição por pesticidas4,5,6,7,15. A espécie é encontrada em águas paradas, áreas protegidas ou áreas com habitat variável na Argentina, Uruguai, Paraguai e Brasil16,17 e é considerada estável pela classificação da IUCN devido à sua ampla distribuição e tolerância a diferentes habitats18.
Efeitos subletais foram relatados em anfíbios após exposição à cipermetrina, incluindo alterações comportamentais, morfológicas e bioquímicas em girinos23,24,25, alterações na mortalidade e no tempo de metamorfose, alterações enzimáticas, diminuição do sucesso de eclosão24,25, hiperatividade26, inibição da atividade da colinesterase27 e alterações no desempenho de natação7,28. No entanto, estudos sobre os efeitos genotóxicos da cipermetrina em anfíbios são limitados. Portanto, é importante avaliar a suscetibilidade de espécies de anuros à cipermetrina.
A poluição ambiental afeta o crescimento e o desenvolvimento normais dos anfíbios, mas o efeito adverso mais grave é o dano genético ao DNA causado pela exposição a pesticidas13. A análise da morfologia das células sanguíneas é um importante bioindicador de poluição e da potencial toxicidade de uma substância para espécies selvagens29. O teste de micronúcleos é um dos métodos mais comumente usados para determinar a genotoxicidade de substâncias químicas no ambiente30. É um método rápido, eficaz e de baixo custo, que constitui um bom indicador de poluição química em organismos como os anfíbios31,32 e pode fornecer informações sobre a exposição a poluentes genotóxicos33.
O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial tóxico de formulações comerciais de cipermetrina para girinos aquáticos de pequeno porte, utilizando um teste de micronúcleos e uma avaliação de risco ecológico.
Mortalidade cumulativa (%) de girinos de P. gracilis expostos a diferentes concentrações de cipermetrina comercial durante o período agudo do teste.
Mortalidade cumulativa (%) de girinos de P. gracilis expostos a diferentes concentrações de cipermetrina comercial durante um teste crônico.
A alta mortalidade observada foi resultado de efeitos genotóxicos em anfíbios expostos a diferentes concentrações de cipermetrina (6 e 20 μg/L), como evidenciado pela presença de micronúcleos (MN) e anormalidades nucleares em eritrócitos. A formação de MN indica erros na mitose e está associada à má ligação dos cromossomos aos microtúbulos, defeitos em complexos proteicos responsáveis pela captação e transporte de cromossomos, erros na segregação cromossômica e erros no reparo de danos ao DNA38,39, podendo estar relacionada ao estresse oxidativo induzido por pesticidas40,41. Outras anormalidades foram observadas em todas as concentrações avaliadas. O aumento das concentrações de cipermetrina elevou as anormalidades nucleares em eritrócitos em 5% e 20% nas doses mais baixa (1 μg/L) e mais alta (20 μg/L), respectivamente. Por exemplo, alterações no DNA de uma espécie podem ter consequências graves para a sobrevivência a curto e longo prazo, resultando em declínio populacional, alteração da aptidão reprodutiva, endogamia, perda de diversidade genética e alteração das taxas de migração. Todos esses fatores podem impactar a sobrevivência e a manutenção da espécie42,43. A formação de anormalidades eritroides pode indicar um bloqueio na citocinese, resultando em divisão celular anormal (eritrócitos binucleados)44,45; núcleos multilobados são protrusões da membrana nuclear com múltiplos lóbulos46, enquanto outras anormalidades eritroides podem estar associadas à amplificação do DNA, como rins/blebs nucleares47. A presença de eritrócitos anucleados pode indicar comprometimento do transporte de oxigênio, especialmente em água contaminada48,49. A apoptose indica morte celular50.
Outros estudos também demonstraram os efeitos genotóxicos da cipermetrina. Kabaña et al.51 demonstraram a presença de micronúcleos e alterações nucleares, como células binucleadas e células apoptóticas em células de Odontophrynus americanus após exposição a altas concentrações de cipermetrina (5000 e 10.000 μg L−1) por 96 h. A apoptose induzida por cipermetrina também foi detectada em P. biligonigerus52 e Rhinella arenarum53. Esses resultados sugerem que a cipermetrina tem efeitos genotóxicos em uma variedade de organismos aquáticos e que o ensaio de MN e ENA pode ser um indicador de efeitos subletais em anfíbios e pode ser aplicável a espécies nativas e populações selvagens expostas a substâncias tóxicas12.
Formulações comerciais de cipermetrina representam um alto risco ambiental (tanto agudo quanto crônico), com níveis de hidroxila (HQ) superiores ao nível da Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA)54, o que pode afetar adversamente a espécie se presente no ambiente. Na avaliação de risco crônico, o NOEC para mortalidade foi de 3 μg L−1, confirmando que as concentrações encontradas na água podem representar um risco para a espécie55. O NOEC letal para larvas de R. arenarum expostas a uma mistura de endosulfan e cipermetrina foi de 500 μg L−1 após 168 h; esse valor diminuiu para 0,0005 μg L−1 após 336 h. Os autores mostram que quanto maior o tempo de exposição, menores as concentrações prejudiciais à espécie. É importante destacar também que os valores de NOEC foram maiores do que os de P. gracilis no mesmo tempo de exposição, indicando que a resposta da espécie à cipermetrina é específica para cada espécie. Além disso, em termos de mortalidade, o valor de CHQ de P. gracilis após exposição à cipermetrina atingiu 64,67, superior ao valor de referência estabelecido pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA)⁵⁴, e o valor de CHQ das larvas de R. arenarum também foi superior a esse valor (CHQ > 388,00 após 336 h), indicando que os inseticidas estudados representam um alto risco para diversas espécies de anfíbios. Considerando que P. gracilis leva aproximadamente 30 dias para completar a metamorfose⁵⁶, pode-se concluir que as concentrações de cipermetrina estudadas podem contribuir para o declínio populacional, impedindo que os indivíduos infectados atinjam a fase adulta ou reprodutiva precocemente.
Na avaliação de risco calculado para micronúcleos e outras anormalidades nucleares de eritrócitos, os valores de CHQ variaram de 14,92 a 97,00, indicando que a cipermetrina apresentou um potencial risco genotóxico para *P. gracilis* mesmo em seu habitat natural. Considerando a mortalidade, a concentração máxima de compostos xenobióticos tolerável para *P. gracilis* foi de 4,24 μg L⁻¹. No entanto, concentrações tão baixas quanto 1 μg/L também apresentaram efeitos genotóxicos. Esse fato pode levar a um aumento no número de indivíduos anormais⁵⁷ e afetar o desenvolvimento e a reprodução da espécie em seus habitats, resultando em um declínio nas populações de anfíbios.
Formulações comerciais do inseticida cipermetrina demonstraram alta toxicidade aguda e crônica para *P. gracilis*. Observaram-se maiores taxas de mortalidade, provavelmente devido aos efeitos tóxicos, evidenciados pela presença de micronúcleos e anormalidades nucleares em eritrócitos, especialmente núcleos serrilhados, lobados e vesiculares. Além disso, a espécie estudada apresentou aumento dos riscos ambientais, tanto agudos quanto crônicos. Esses dados, combinados com estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, mostraram que mesmo diferentes formulações comerciais de cipermetrina ainda causaram diminuição das atividades da acetilcolinesterase (AChE) e da butirilcolinesterase (BChE) e estresse oxidativo58, resultando em alterações na atividade natatória e malformações orais59 em *P. gracilis*, indicando que as formulações comerciais de cipermetrina apresentam alta toxicidade letal e subletal para essa espécie. Hartmann et al. O estudo 60 constatou que as formulações comerciais de cipermetrina foram as mais tóxicas para *P. gracilis* e outra espécie do mesmo gênero (*P. cuvieri*) em comparação com outros nove pesticidas. Isso sugere que as concentrações de cipermetrina legalmente aprovadas para proteção ambiental podem resultar em alta mortalidade e declínio populacional a longo prazo.
São necessários mais estudos para avaliar a toxicidade do pesticida para anfíbios, visto que as concentrações encontradas no ambiente podem causar alta mortalidade e representar um risco potencial para *P. gracilis*. Pesquisas sobre espécies de anfíbios devem ser incentivadas, pois os dados sobre esses organismos são escassos, particularmente sobre espécies brasileiras.
O teste de toxicidade crônica durou 168 h (7 dias) em condições estáticas, e as concentrações subletais foram de 1, 3, 6 e 20 μg i.a. L−1. Em ambos os experimentos, 10 girinos por grupo de tratamento foram avaliados com seis repetições, totalizando 60 girinos por concentração. O tratamento apenas com água serviu como controle negativo. Cada experimento consistiu em uma placa de Petri estéril com capacidade de 500 ml e uma densidade de 1 girino por 50 ml de solução. A placa foi coberta com filme de polietileno para evitar a evaporação e mantida sob aeração contínua.
A água foi analisada quimicamente para determinar as concentrações de pesticidas em 0, 96 e 168 h. De acordo com Sabin et al. 68 e Martins et al. 69, as análises foram realizadas no Laboratório de Análise de Pesticidas (LARP) da Universidade Federal de Santa Maria, utilizando cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas com triplo quadrupolo (Varian modelo 1200, Palo Alto, Califórnia, EUA). A determinação quantitativa de pesticidas na água é apresentada como material suplementar (Tabela SM1).
Para o teste de micronúcleos (TMN) e o teste de anormalidades nucleares em eritrócitos (RNA), 15 girinos de cada grupo de tratamento foram analisados. Os girinos foram anestesiados com lidocaína a 5% (50 mg g⁻¹) e as amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca utilizando seringas heparinizadas descartáveis. Esfregaços sanguíneos foram preparados em lâminas de microscópio estéreis, secos ao ar, fixados com metanol a 100% (4 °C) por 2 minutos e, em seguida, corados com solução de Giemsa a 10% por 15 minutos no escuro. Ao final do processo, as lâminas foram lavadas com água destilada para remover o excesso de corante e secas à temperatura ambiente.
Pelo menos 1000 hemácias de cada girino foram analisadas usando um microscópio de 100× com uma objetiva de 71x para determinar a presença de MN e ENA. Um total de 75.796 hemácias de girinos foram avaliadas considerando as concentrações de cipermetrina e os controles. A genotoxicidade foi analisada de acordo com o método de Carrasco et al. e Fenech et al.38,72 determinando a frequência das seguintes lesões nucleares: (1) células anucleadas: células sem núcleo; (2) células apoptóticas: fragmentação nuclear, morte celular programada; (3) células binucleadas: células com dois núcleos; (4) brotamentos nucleares ou células com blebs: células com núcleos com pequenas protrusões da membrana nuclear, blebs de tamanho semelhante a micronúcleos; (5) células cariolisadas: células com apenas o contorno do núcleo sem material interno; (6) células entalhadas: células com núcleos apresentando fissuras ou entalhes evidentes em sua forma, também chamadas de núcleos em forma de rim; (7) células lobuladas: células com protrusões nucleares maiores que as vesículas mencionadas anteriormente; e (8) microcélulas: células com núcleos condensados e citoplasma reduzido. As alterações foram comparadas com os resultados do controle negativo.
Os resultados do teste de toxicidade aguda (CL50) foram analisados utilizando o software GBasic e o método TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Os dados do teste crônico foram pré-testados quanto à normalidade dos erros (Shapiro-Wilk) e homogeneidade da variância (Bartlett). Os resultados foram analisados utilizando análise de variância (ANOVA) de uma via. O teste de Tukey foi utilizado para comparar os dados entre si, e o teste de Dunnett foi utilizado para comparar os dados entre o grupo de tratamento e o grupo controle negativo.
Os dados de LOEC e NOEC foram analisados utilizando o teste de Dunnett. Os testes estatísticos foram realizados utilizando o software Statistica 8.0 (StatSoft) com um nível de significância de 95% (p < 0,05).
Data da publicação: 13/03/2025