Este estudo avaliou a letalidade, subletalidade e toxicidade de pesticidas comerciaiscipermetrinaformulações para girinos de anuros. No teste agudo, concentrações de 100–800 μg/L foram testadas por 96 h. No teste crônico, concentrações de cipermetrina de ocorrência natural (1, 3, 6 e 20 μg/L) foram testadas para mortalidade, seguidas por testes de micronúcleo e anormalidades nucleares de hemácias por 7 dias. A CL50 da formulação comercial de cipermetrina para girinos foi de 273,41 μg L−1. No teste crônico, a maior concentração (20 μg L−1) resultou em mortalidade superior a 50%, pois matou metade dos girinos testados. O teste de micronúcleo mostrou resultados significativos em 6 e 20 μg L−1 e várias anormalidades nucleares foram detectadas, indicando que a formulação comercial de cipermetrina tem potencial genotóxico contra P. gracilis. A cipermetrina representa um alto risco para esta espécie, indicando que pode causar múltiplos problemas e afetar a dinâmica deste ecossistema a curto e longo prazo. Portanto, pode-se concluir que as formulações comerciais de cipermetrina apresentam efeitos tóxicos sobre P. gracilis.
Devido à expansão contínua das atividades agrícolas e à aplicação intensiva decontrole de pragasAlém disso, os animais aquáticos são frequentemente expostos a pesticidas1,2. A poluição dos recursos hídricos próximos a campos agrícolas pode afetar o desenvolvimento e a sobrevivência de organismos não-alvo, como os anfíbios.
Os anfíbios estão se tornando cada vez mais importantes na avaliação de matrizes ambientais. Os anuros são considerados bons bioindicadores de poluentes ambientais devido às suas características únicas, como ciclos de vida complexos, rápidas taxas de crescimento larval, estado trófico, pele permeável10,11, dependência de água para reprodução12 e ovos desprotegidos11,13,14. A pequena rã-d'água (Physalaemus gracilis), comumente conhecida como rã-chorona, demonstrou ser uma espécie bioindicadora de poluição por pesticidas4,5,6,7,15. A espécie é encontrada em águas paradas, áreas protegidas ou áreas com habitat variável na Argentina, Uruguai, Paraguai e Brasil1617 e é considerada estável pela classificação da IUCN devido à sua ampla distribuição e tolerância a diferentes habitats18.
Efeitos subletais foram relatados em anfíbios após exposição à cipermetrina, incluindo alterações comportamentais, morfológicas e bioquímicas em girinos23,24,25, alteração na mortalidade e no tempo de metamorfose, alterações enzimáticas, diminuição do sucesso de eclosão24,25, hiperatividade26, inibição da atividade da colinesterase27 e alterações no desempenho natatório7,28. No entanto, estudos sobre os efeitos genotóxicos da cipermetrina em anfíbios são limitados. Portanto, é importante avaliar a suscetibilidade de espécies de anuros à cipermetrina.
A poluição ambiental afeta o crescimento e o desenvolvimento normais dos anfíbios, mas o efeito adverso mais grave é o dano genético ao DNA causado pela exposição a pesticidas13. A análise da morfologia das células sanguíneas é um importante bioindicador de poluição e da potencial toxicidade de uma substância para espécies selvagens29. O teste do micronúcleo é um dos métodos mais utilizados para determinar a genotoxicidade de substâncias químicas no ambiente30. É um método rápido, eficaz e barato, sendo um bom indicador da poluição química de organismos como anfíbios31,32 e pode fornecer informações sobre a exposição a poluentes genotóxicos33.
O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial tóxico de formulações comerciais de cipermetrina para pequenos girinos aquáticos usando um teste de micronúcleo e avaliação de risco ecológico.
Mortalidade cumulativa (%) de girinos de P. gracilis expostos a diferentes concentrações de cipermetrina comercial durante o período agudo do teste.
Mortalidade cumulativa (%) de girinos de P. gracilis expostos a diferentes concentrações de cipermetrina comercial durante um teste crônico.
A alta mortalidade observada foi resultado de efeitos genotóxicos em anfíbios expostos a diferentes concentrações de cipermetrina (6 e 20 μg/L), evidenciados pela presença de micronúcleos (MN) e anormalidades nucleares em eritrócitos. A formação de MN indica erros na mitose e está associada à má ligação dos cromossomos aos microtúbulos, defeitos em complexos proteicos responsáveis pela captação e transporte dos cromossomos, erros na segregação cromossômica e erros no reparo de danos ao DNA38,39 e pode estar relacionada ao estresse oxidativo induzido por pesticidas40,41. Outras anormalidades foram observadas em todas as concentrações avaliadas. O aumento das concentrações de cipermetrina aumentou as anormalidades nucleares nos eritrócitos em 5% e 20% nas doses mais baixa (1 μg/L) e mais alta (20 μg/L), respectivamente. Por exemplo, alterações no DNA de uma espécie podem ter consequências graves para a sobrevivência a curto e longo prazo, resultando em declínio populacional, alteração da aptidão reprodutiva, endogamia, perda de diversidade genética e taxas de migração alteradas. Todos esses fatores podem impactar a sobrevivência e a manutenção das espécies42,43. A formação de anormalidades eritroides pode indicar um bloqueio na citocinese, resultando em divisão celular anormal (eritrócitos binucleados)44,45; núcleos multilobados são protrusões da membrana nuclear com múltiplos lobos46, enquanto outras anormalidades eritroides podem estar associadas à amplificação do DNA, como rins/bolhas nucleares47. A presença de eritrócitos anucleados pode indicar transporte de oxigênio prejudicado, especialmente em água contaminada48,49. A apoptose indica morte celular50.
Outros estudos também demonstraram os efeitos genotóxicos da cipermetrina. Kabaña et al. 51 demonstraram a presença de micronúcleos e alterações nucleares, como células binucleadas e células apoptóticas em células de Odontophrynus americanus após exposição a altas concentrações de cipermetrina (5.000 e 10.000 μg L−1) por 96 h. A apoptose induzida por cipermetrina também foi detectada em P. biligonigerus 52 e Rhinella arenarum 53. Esses resultados sugerem que a cipermetrina tem efeitos genotóxicos em uma variedade de organismos aquáticos e que o ensaio MN e ENA pode ser um indicador de efeitos subletais em anfíbios e pode ser aplicável a espécies nativas e populações selvagens expostas a tóxicos 12.
Formulações comerciais de cipermetrina representam um alto risco ambiental (tanto agudo quanto crônico), com HQs excedendo o nível da Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA)54 que pode afetar adversamente a espécie se presente no ambiente. Na avaliação de risco crônico, o NOEC para mortalidade foi de 3 μg L−1, confirmando que as concentrações encontradas na água podem representar um risco para a espécie55. O NOEC letal para larvas de R. arenarum expostas a uma mistura de endosulfan e cipermetrina foi de 500 μg L−1 após 168 h; este valor diminuiu para 0,0005 μg L−1 após 336 h. Os autores mostram que quanto maior a exposição, menores as concentrações que são prejudiciais à espécie. Também é importante destacar que os valores de NOEC foram maiores do que aqueles de P. gracilis no mesmo tempo de exposição, indicando que a resposta da espécie à cipermetrina é espécie-específica. Além disso, em termos de mortalidade, o valor de CHQ de P. gracilis após exposição à cipermetrina atingiu 64,67, valor superior ao valor de referência estabelecido pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA54, e o valor de CHQ de larvas de R. arenarum também foi superior a esse valor (CHQ > 388,00 após 336 h), indicando que os inseticidas estudados representam um alto risco para diversas espécies de anfíbios. Considerando que P. gracilis requer aproximadamente 30 dias para completar a metamorfose56, pode-se concluir que as concentrações estudadas de cipermetrina podem contribuir para o declínio populacional, impedindo que indivíduos infectados entrem na fase adulta ou reprodutiva em idade precoce.
Na avaliação de risco calculada para micronúcleos e outras anormalidades nucleares eritrocitárias, os valores de CHQ variaram de 14,92 a 97,00, indicando que a cipermetrina apresentou um risco genotóxico potencial para P. gracilis, mesmo em seu habitat natural. Considerando a mortalidade, a concentração máxima de compostos xenobióticos tolerável para P. gracilis foi de 4,24 μg L−1. No entanto, concentrações tão baixas quanto 1 μg/L também apresentaram efeitos genotóxicos. Esse fato pode levar ao aumento do número de indivíduos anormais57 e afetar o desenvolvimento e a reprodução das espécies em seus habitats, levando ao declínio das populações de anfíbios.
Formulações comerciais do inseticida cipermetrina apresentaram alta toxicidade aguda e crônica para P. gracilis. Maiores taxas de mortalidade foram observadas, provavelmente devido aos efeitos tóxicos, como evidenciado pela presença de micronúcleos e anormalidades nucleares em eritrócitos, especialmente núcleos serrilhados, núcleos lobados e núcleos vesiculares. Além disso, as espécies estudadas apresentaram riscos ambientais aumentados, tanto agudos quanto crônicos. Esses dados, combinados com estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa, mostraram que mesmo diferentes formulações comerciais de cipermetrina ainda causaram diminuição das atividades de acetilcolinesterase (AChE) e butirilcolinesterase (BChE) e estresse oxidativo58, e resultaram em alterações na atividade de natação e malformações orais59 em P. gracilis, indicando que formulações comerciais de cipermetrina têm alta toxicidade letal e subletal para esta espécie. Hartmann et al. 60 constataram que as formulações comerciais de cipermetrina foram as mais tóxicas para P. gracilis e outra espécie do mesmo gênero (P. cuvieri), em comparação com outros nove pesticidas. Isso sugere que concentrações legalmente aprovadas de cipermetrina para proteção ambiental podem resultar em alta mortalidade e declínio populacional a longo prazo.
Mais estudos são necessários para avaliar a toxicidade do pesticida para anfíbios, visto que as concentrações encontradas no ambiente podem causar alta mortalidade e representar um risco potencial para P. gracilis. Pesquisas com espécies de anfíbios devem ser incentivadas, visto que dados sobre esses organismos são escassos, principalmente sobre espécies brasileiras.
O teste de toxicidade crônica durou 168 h (7 dias) em condições estáticas e as concentrações subletais foram: 1, 3, 6 e 20 μg ia L−1. Em ambos os experimentos, 10 girinos por grupo de tratamento foram avaliados com seis repetições, totalizando 60 girinos por concentração. Enquanto isso, o tratamento somente com água serviu como controle negativo. Cada configuração experimental consistiu em um recipiente de vidro estéril com capacidade de 500 ml e densidade de 1 girino por 50 ml de solução. O frasco foi coberto com filme plástico para evitar evaporação e foi continuamente aerado.
A água foi analisada quimicamente para determinar as concentrações de pesticidas em 0, 96 e 168 h. De acordo com Sabin et al. 68 e Martins et al. 69, as análises foram realizadas no Laboratório de Análise de Pesticidas (LARP) da Universidade Federal de Santa Maria, utilizando cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas triplo quadrupolo (Varian modelo 1200, Palo Alto, Califórnia, EUA). A determinação quantitativa de pesticidas na água é apresentada como material suplementar (Tabela SM1).
Para o teste do micronúcleo (MNT) e o teste de anormalidade nuclear em hemácias (RNA), 15 girinos de cada grupo de tratamento foram analisados. Os girinos foram anestesiados com lidocaína a 5% (50 mg g-170) e amostras de sangue foram coletadas por punção cardíaca com seringas heparinizadas descartáveis. Esfregaços de sangue foram preparados em lâminas de microscópio estéreis, secos ao ar, fixados com metanol 100% (4 °C) por 2 minutos e, em seguida, corados com solução de Giemsa a 10% por 15 minutos no escuro. Ao final do processo, as lâminas foram lavadas com água destilada para remover o excesso de corante e secas à temperatura ambiente.
Pelo menos 1000 hemácias de cada girino foram analisadas usando um microscópio de 100× com uma objetiva de 71 para determinar a presença de MN e ENA. Um total de 75.796 hemácias de girinos foram avaliadas considerando as concentrações de cipermetrina e controles. A genotoxicidade foi analisada de acordo com o método de Carrasco et al. e Fenech et al.38,72 determinando a frequência das seguintes lesões nucleares: (1) células anucleadas: células sem núcleos; (2) células apoptóticas: fragmentação nuclear, morte celular programada; (3) células binucleadas: células com dois núcleos; (4) brotos nucleares ou células bleb: células com núcleos com pequenas protrusões da membrana nuclear, bolhas semelhantes em tamanho a micronúcleos; (5) células cariolisadas: células com apenas o contorno do núcleo sem material interno; (6) células entalhadas: células com núcleos com rachaduras ou entalhes evidentes em seu formato, também chamadas de núcleos em formato de rim; (7) células lobuladas: células com protrusões nucleares maiores que as vesículas mencionadas; e (8) microcélulas: células com núcleos condensados e citoplasma reduzido. As alterações foram comparadas com os resultados do controle negativo.
Os resultados dos testes de toxicidade aguda (CL50) foram analisados utilizando o software GBasic e o método TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Os dados dos testes crônicos foram pré-testados quanto à normalidade do erro (Shapiro-Wilks) e à homogeneidade da variância (Bartlett). Os resultados foram analisados utilizando análise de variância (ANOVA) unidirecional. O teste de Tukey foi utilizado para comparar os dados entre si, e o teste de Dunnett para comparar os dados entre o grupo de tratamento e o grupo de controle negativo.
Os dados de LOEC e NOEC foram analisados pelo teste de Dunnett. Os testes estatísticos foram realizados no software Statistica 8.0 (StatSoft) com nível de significância de 95% (p < 0,05).
Horário da publicação: 13/03/2025