As proteínas DELLA são mestres conservadosreguladores de crescimentoque desempenham um papel central no controle do desenvolvimento da planta em resposta a estímulos internos e ambientais. DELLA atua como um regulador transcricional e é recrutado para atingir promotores ligando-se a fatores de transcrição (FTs) e à histona H2A por meio de seu domínio GRAS. Estudos recentes demonstraram que a estabilidade de DELLA é regulada pós-traducionalmente por meio de dois mecanismos: poliubiquitinação induzida pelo fitohormônio giberelina, que leva à sua rápida degradação, e conjugação de pequenos modificadores semelhantes à ubiquitina (SUMO) para aumentar seu acúmulo. Além disso, a atividade de DELLA é regulada dinamicamente por duas glicosilações diferentes: a interação DELLA-FT é aumentada pela O-fucosilação, mas inibida pela modificação da N-acetilglucosamina ligada à O (O-GlcNAc). No entanto, o papel da fosforilação de DELLA permanece obscuro, visto que estudos anteriores apresentaram resultados conflitantes, desde aqueles que demonstram que a fosforilação promove ou reduz a degradação de DELLA até outros que demonstram que a fosforilação não afeta sua estabilidade. Aqui, identificamos sítios de fosforilação em REPRESSORga1-3(RGA, AtDELLA) purificados de Arabidopsis thaliana por análise de espectrometria de massas mostram que a fosforilação de dois peptídeos RGA nas regiões PolyS e PolyS/T promove a ligação de H2A e aumenta a atividade de RGA. Associação de RGA com promotores-alvo. Notavelmente, a fosforilação não afeta as interações RGA-TF nem a estabilidade de RGA. Nosso estudo revela o mecanismo molecular pelo qual a fosforilação induz a atividade de DELLA.
Para elucidar o papel da fosforilação na regulação da função de DELLA, é fundamental identificar os sítios de fosforilação de DELLA in vivo e realizar análises funcionais em plantas. Por meio da purificação por afinidade de extratos vegetais seguida de análise por MS/MS, identificamos diversos fosfossítios em RGA. Em condições de deficiência de GA, a fosforilação de RHA aumenta, mas não afeta sua estabilidade. É importante ressaltar que ensaios de co-IP e ChIP-qPCR revelaram que a fosforilação na região PolyS/T de RGA promove sua interação com H2A e sua associação com promotores-alvo, revelando o mecanismo pelo qual a fosforilação induz a função de RGA.
O RGA é recrutado para atingir a cromatina por meio da interação do subdomínio LHR1 com o TF e, em seguida, liga-se ao H2A por meio de sua região PolyS/T e do subdomínio PFYRE, formando o complexo H2A-RGA-TF para estabilizar o RGA. A fosforilação do Pep 2 na região PolyS/T, entre o domínio DELLA e o domínio GRAS, por uma cinase não identificada, aumenta a ligação do RGA ao H2A. A proteína mutante rgam2A abole a fosforilação do RGA e adota uma conformação proteica diferente para interferir na ligação ao H2A. Isso resulta na desestabilização das interações transitórias entre o TF e o rgam2A e na dissociação do rgam2A da cromatina alvo. Esta figura representa apenas a repressão transcricional mediada por RGA. Um padrão semelhante poderia ser descrito para a ativação transcricional mediada por RGA, exceto que o complexo H2A-RGA-TF promoveria a transcrição do gene alvo e a desfosforilação do rgam2A diminuiria a transcrição. Figura modificada de Huang et al.21.
Todos os dados quantitativos foram analisados estatisticamente usando o Excel, e as diferenças significativas foram determinadas usando o teste t de Student. Nenhum método estatístico foi utilizado para determinar preliminarmente o tamanho da amostra. Nenhum dado foi excluído da análise; o experimento não foi randomizado; os pesquisadores não estavam cegos à distribuição dos dados durante o experimento e à avaliação dos resultados. O tamanho da amostra está indicado na legenda da figura e no arquivo de dados de origem.
Para mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o Resumo do Relatório de Portfólio Natural associado a este artigo.
Dados proteômicos de espectrometria de massa foram fornecidos ao consórcio ProteomeXchange por meio do repositório de parceiros PRIDE66 com o identificador de conjunto de dados PXD046004. Todos os outros dados obtidos durante este estudo são apresentados nas Informações Suplementares, Arquivos de Dados Suplementares e Arquivos de Dados Brutos. Os dados de origem são fornecidos para este artigo.
Horário da postagem: 08/11/2024