As proteínas DELLA são proteínas mestras conservadasreguladores de crescimentoque desempenham um papel central no controle do desenvolvimento vegetal em resposta a estímulos internos e ambientais. A DELLA atua como um regulador transcricional e é recrutada para promotores-alvo por meio da ligação a fatores de transcrição (FTs) e à histona H2A através de seu domínio GRAS. Estudos recentes demonstraram que a estabilidade da DELLA é regulada pós-traducionalmente por dois mecanismos: a poliubiquitinação induzida pelo fitohormônio giberelina, que leva à sua rápida degradação, e a conjugação de modificadores semelhantes à ubiquitina (SUMO) para aumentar seu acúmulo. Além disso, a atividade da DELLA é regulada dinamicamente por duas glicosilações diferentes: a interação DELLA-FT é intensificada pela O-fucosilação, mas inibida pela modificação com N-acetilglicosamina ligada a O (O-GlcNAc). No entanto, o papel da fosforilação de DELLA permanece incerto, visto que estudos anteriores apresentaram resultados conflitantes, desde aqueles que demonstram que a fosforilação promove ou reduz a degradação de DELLA até outros que mostram que a fosforilação não afeta sua estabilidade. Aqui, identificamos sítios de fosforilação em REPRESSOR.ga1-3(RGA, AtDELLA) purificado de Arabidopsis thaliana por análise de espectrometria de massa e mostra que a fosforilação de dois peptídeos RGA nas regiões PolyS e PolyS/T promove a ligação ao H2A e aumenta a atividade do RGA. Associação do RGA com promotores-alvo. Notavelmente, a fosforilação não afeta as interações RGA-TF nem a estabilidade do RGA. Nosso estudo revela o mecanismo molecular pelo qual a fosforilação induz a atividade de DELLA.
Para elucidar o papel da fosforilação na regulação da função de DELLA, é crucial identificar os sítios de fosforilação de DELLA in vivo e realizar análises funcionais em plantas. Por meio da purificação por afinidade de extratos vegetais seguida de análise MS/MS, identificamos diversos fosfossítios em RGA. Em condições de deficiência de GA, a fosforilação de RHA aumenta, mas não afeta sua estabilidade. De forma importante, ensaios de co-imunoprecipitação (co-IP) e ChIP-qPCR revelaram que a fosforilação na região PolyS/T de RGA promove sua interação com H2A e sua associação com promotores-alvo, revelando o mecanismo pelo qual a fosforilação induz a função de RGA.
A RGA é recrutada para a cromatina alvo através da interação do subdomínio LHR1 com o TF e, em seguida, liga-se à H2A através de sua região PolyS/T e subdomínio PFYRE, formando o complexo H2A-RGA-TF para estabilizar a RGA. A fosforilação do Pep 2 na região PolyS/T entre o domínio DELLA e o domínio GRAS por uma quinase não identificada aumenta a ligação RGA-H2A. A proteína mutante rgam2A abole a fosforilação da RGA e adota uma conformação proteica diferente para interferir na ligação à H2A. Isso resulta na desestabilização das interações transitórias TF-rgam2A e na dissociação da rgam2A da cromatina alvo. Esta figura representa apenas a repressão transcricional mediada por RGA. Um padrão semelhante poderia ser descrito para a ativação transcricional mediada por RGA, exceto que o complexo H2A-RGA-TF promoveria a transcrição do gene alvo e a desfosforilação da rgam2A diminuiria a transcrição. Figura modificada de Huang et al.21.
Todos os dados quantitativos foram analisados estatisticamente utilizando o Excel, e as diferenças significativas foram determinadas pelo teste t de Student. Nenhum método estatístico foi utilizado para determinar preliminarmente o tamanho da amostra. Nenhum dado foi excluído da análise; o experimento não foi randomizado; os pesquisadores não estavam cegos quanto à distribuição dos dados durante o experimento e a avaliação dos resultados. O tamanho da amostra está indicado na legenda da figura e no arquivo de dados original.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o Resumo do Relatório de Portfólio Natural associado a este artigo.
Os dados de proteômica por espectrometria de massa foram disponibilizados no consórcio ProteomeXchange por meio do repositório parceiro PRIDE66, com o identificador de conjunto de dados PXD046004. Todos os demais dados obtidos durante este estudo estão apresentados nas Informações Suplementares, nos Arquivos de Dados Suplementares e nos Arquivos de Dados Brutos. Os dados de origem são fornecidos para este artigo.
Data da publicação: 08/11/2024