As proteínas DELLA são conservadasreguladores de crescimentoque desempenham um papel central no desenvolvimento das plantas em resposta a sinais internos e externos. Como reguladores transcricionais, os DELLAs ligam-se a fatores de transcrição (FTs) e à histona H2A por meio de seus domínios GRAS e são recrutados para atuar em promotores. Estudos recentes demonstraram que a estabilidade dos DELLAs é regulada pós-traducionalmente por dois mecanismos: poliubiquitinação induzida pelo hormônio vegetalgiberelina, o que leva à sua rápida degradação, e conjugação com pequeno modificador semelhante à ubiquitina (SUMO), o que aumenta seu acúmulo. Além disso, a atividade de DELLA é regulada dinamicamente por dois mecanismos distintos de glicosilação: a O-fucosilação aumenta a interação DELLA-TF, enquanto a modificação da N-acetilglucosamina ligada à O (O-GlcNAc) inibe a interação DELLA-TF. No entanto, o papel da fosforilação de DELLA não é claro, pois estudos anteriores mostraram resultados conflitantes, com alguns sugerindo que a fosforilação promove ou reprime a degradação de DELLA e outros sugerindo que a fosforilação não afeta sua estabilidade. Aqui, identificamos sítios de fosforilação no repressor GA1-3 (RGA), AtDELLA, purificado de Arabidopsis thaliana por espectrometria de massas e mostramos que a fosforilação de dois peptídeos RGA nas regiões PolyS e PolyS/T aumenta a atividade de RGA promovendo a ligação de H2A e a associação de RGA com promotores alvo. Notavelmente, a fosforilação não afetou as interações RGA-TF nem a estabilidade do RGA. Nosso estudo revela um mecanismo molecular pelo qual a fosforilação induz a atividade DELLA.
Nossa análise espectrométrica de massa revelou que tanto Pep1 quanto Pep2 foram altamente fosforilados em RGA no contexto de Ga1 deficiente em GA. Além deste estudo, estudos fosfoproteômicos também revelaram a fosforilação de Pep1 em RGA, embora seu papel ainda não tenha sido estudado53,54,55. Em contraste, a fosforilação de Pep2 não foi descrita anteriormente, uma vez que este peptídeo só pôde ser detectado usando o transgene RGAGKG. Embora a mutação m1A, que aboliu a fosforilação de Pep1, tenha reduzido apenas ligeiramente a atividade de RGA in planta, ela teve um efeito aditivo quando combinada com m2A na redução da atividade de RGA (Figura Suplementar 6). Importantemente, a fosforilação de Pep1 foi significativamente reduzida no mutante sly1 aprimorado por GA em comparação com ga1, sugerindo que GA promove a desfosforilação de RGA, reduzindo sua atividade. O mecanismo pelo qual GA suprime a fosforilação de RGA requer mais investigação. Uma possibilidade é que isso seja alcançado através da regulação de uma proteína quinase não identificada. Embora estudos tenham demonstrado que a expressão da proteína cinase EL1 da CK1 é regulada negativamente por GA em arroz41, nossos resultados indicam que mutações de ordem superior do homólogo de EL1 de Arabidopsis (AEL1-4) não reduzem a fosforilação de RGA. Em concordância com nossos resultados, um estudo fosfoproteômico recente utilizando linhagens superexpressoras de AEL de Arabidopsis e um mutante triplo ael não identificou nenhuma proteína DELLA como substrato dessas cinases56. Quando preparamos o manuscrito, foi relatado que GSK3, o gene que codifica uma cinase semelhante a GSK3/SHAGGY em trigo (Triticum aestivum), pode fosforilar DELLA (Rht-B1b)57, embora a fosforilação de Rht-B1b por GSK3 não tenha sido confirmada in planta. Reações enzimáticas in vitro na presença de GSK3, seguidas de análise por espectrometria de massas, revelaram três sítios de fosforilação localizados entre os domínios DELLA e GRAS de Rht-B1b (Fig. Suplementar 3). Substituições de serina por alanina em todos os três sítios de fosforilação resultaram em diminuição da atividade de Rht-B1b em trigo transgênico, consistente com nossos achados de que as substituições de alanina em Pep2 RGA diminuíram a atividade de RGA. No entanto, ensaios de degradação proteica in vitro demonstraram ainda que a fosforilação também pode estabilizar Rht-B1b57. Isso contrasta com nossos resultados, que mostram que as substituições de alanina em Pep2 RGA não alteram sua estabilidade in planta. GSK3 no trigo é um ortólogo da proteína 2 insensível a brassinosteróides (BIN2) em Arabidopsis 57. BIN2 é um regulador negativo da sinalização BR, e BR ativa sua via de sinalização causando degradação de BIN2 58. Mostramos que o tratamento com BR não reduz a estabilidade de RGA 59 ou os níveis de fosforilação em Arabidopsis (Figura Suplementar 2), sugerindo que é improvável que RGA seja fosforilada por BIN2.
Todos os dados quantitativos foram analisados estatisticamente usando o Excel, e as diferenças significativas foram determinadas usando o teste t de Student. Nenhum método estatístico foi utilizado para pré-determinar o tamanho da amostra. Nenhum dado foi excluído da análise; o experimento não foi randomizado; e os pesquisadores estavam cientes da alocação durante o experimento e a avaliação dos resultados. Os tamanhos das amostras são fornecidos nas legendas das figuras e nos arquivos de dados brutos.
Horário da publicação: 15/04/2025