As proteínas DELLA são conservadas.reguladores de crescimentoque desempenham um papel central no desenvolvimento vegetal em resposta a sinais internos e externos. Como reguladores transcricionais, as proteínas DELLA ligam-se a fatores de transcrição (FTs) e à histona H2A através de seus domínios GRAS e são recrutadas para atuar em promotores. Estudos recentes demonstraram que a estabilidade das proteínas DELLA é regulada pós-traducionalmente por dois mecanismos: poliubiquitinação induzida pelo hormônio vegetal.giberelina, o que leva à sua rápida degradação, e à conjugação com o modificador pequeno semelhante à ubiquitina (SUMO), o que aumenta seu acúmulo. Além disso, a atividade de DELLA é regulada dinamicamente por dois mecanismos distintos de glicosilação: a O-fucosilação aumenta a interação DELLA-TF, enquanto a modificação por N-acetilglicosamina ligada a O (O-GlcNAc) inibe essa interação. No entanto, o papel da fosforilação de DELLA não está claro, visto que estudos anteriores apresentaram resultados conflitantes, com alguns sugerindo que a fosforilação promove ou reprime a degradação de DELLA e outros sugerindo que a fosforilação não afeta sua estabilidade. Aqui, identificamos sítios de fosforilação no repressor GA1-3 (RGA), AtDELLA, purificado de Arabidopsis thaliana por espectrometria de massa, e mostramos que a fosforilação de dois peptídeos RGA nas regiões PolyS e PolyS/T aumenta a atividade de RGA, promovendo a ligação de H2A e a associação de RGA com promotores-alvo. Notavelmente, a fosforilação não afetou as interações RGA-TF nem a estabilidade da RGA. Nosso estudo revela um mecanismo molecular pelo qual a fosforilação induz a atividade da DELLA.
Nossa análise por espectrometria de massa revelou que tanto Pep1 quanto Pep2 estavam altamente fosforilados em RGA no contexto Ga1 deficiente em GA. Além deste estudo, estudos fosfoproteômicos também revelaram a fosforilação de Pep1 em RGA, embora seu papel ainda não tenha sido estudado53,54,55. Em contraste, a fosforilação de Pep2 não havia sido descrita anteriormente, uma vez que esse peptídeo só pôde ser detectado usando o transgene RGAGKG. Embora a mutação m1A, que aboliu a fosforilação de Pep1, tenha reduzido apenas ligeiramente a atividade de RGA in planta, ela teve um efeito aditivo quando combinada com m2A na redução da atividade de RGA (Figura Suplementar 6). É importante ressaltar que a fosforilação de Pep1 foi significativamente reduzida no mutante sly1 com expressão aumentada de GA em comparação com ga1, sugerindo que o GA promove a desfosforilação de RGA, reduzindo sua atividade. O mecanismo pelo qual o GA suprime a fosforilação de RGA requer investigação adicional. Uma possibilidade é que isso seja alcançado por meio da regulação de uma proteína quinase ainda não identificada. Embora estudos tenham demonstrado que a expressão da proteína quinase CK1 EL1 é regulada negativamente pelo GA no arroz41, nossos resultados indicam que mutações de ordem superior do homólogo de EL1 em Arabidopsis (AEL1-4) não reduzem a fosforilação de RGA. Em concordância com nossos resultados, um estudo fosfoproteômico recente, utilizando linhagens de Arabidopsis superexpressando AEL e um triplo mutante ael, não identificou nenhuma proteína DELLA como substrato dessas quinases56. Quando estávamos preparando o manuscrito, foi relatado que GSK3, o gene que codifica uma quinase semelhante a GSK3/SHAGGY no trigo (Triticum aestivum), pode fosforilar DELLA (Rht-B1b)57, embora a fosforilação de Rht-B1b por GSK3 não tenha sido confirmada in planta. Reações enzimáticas in vitro na presença de GSK3, seguidas por análise de espectrometria de massa, revelaram três sítios de fosforilação localizados entre os domínios DELLA e GRAS de Rht-B1b (Figura Suplementar 3). Substituições de serina por alanina em todos os três sítios de fosforilação resultaram em diminuição da atividade de Rht-B1b em trigo transgênico, o que está de acordo com nossos achados de que substituições de alanina em Pep2 RGA diminuem a atividade de RGA. No entanto, ensaios de degradação de proteínas in vitro demonstraram ainda que a fosforilação também pode estabilizar Rht-B1b57. Isso contrasta com nossos resultados, que mostram que substituições de alanina em Pep2 RGA não alteram sua estabilidade in planta. A GSK3 no trigo é um ortólogo da proteína 2 insensível a brassinosteroides (BIN2) em Arabidopsis 57. A BIN2 é um regulador negativo da sinalização de BR, e o BR ativa sua via de sinalização causando a degradação da BIN2 58. Mostramos que o tratamento com BR não reduz a estabilidade da RGA 59 ou os níveis de fosforilação em Arabidopsis (Figura Suplementar 2), sugerindo que é improvável que a RGA seja fosforilada pela BIN2.
Todos os dados quantitativos foram analisados estatisticamente utilizando o Excel, e as diferenças significativas foram determinadas pelo teste t de Student. Nenhum método estatístico foi utilizado para pré-determinar o tamanho da amostra. Nenhum dado foi excluído da análise; o experimento não foi randomizado; e os pesquisadores tinham conhecimento da alocação durante o experimento e a avaliação dos resultados. Os tamanhos das amostras são apresentados nas legendas das figuras e nos arquivos de dados brutos.
Data da publicação: 15 de abril de 2025