O crescimento do meristema apical caulinar (MAC) é crucial para a arquitetura do caule. Hormônios vegetaisgiberelinasOs glicosilatos (GAs) desempenham papéis fundamentais na coordenação do crescimento vegetal, mas sua função no meristema apical caulinar (SAM) ainda é pouco compreendida. Neste estudo, desenvolvemos um biossensor ratiométrico para a sinalização de GAs, modificando a proteína DELLA para suprimir sua função regulatória essencial na resposta transcricional aos GAs, preservando sua degradação após o reconhecimento destes. Demonstramos que esse biossensor baseado na degradação registra com precisão as alterações nos níveis de GAs e a percepção celular durante o desenvolvimento. Utilizamos esse biossensor para mapear a atividade de sinalização de GAs no SAM. Mostramos que altos níveis de GAs estão presentes predominantemente em células localizadas entre os primórdios dos órgãos, que são precursores das células dos entrenós. Por meio de abordagens de ganho e perda de função, demonstramos ainda que os GAs regulam a orientação do plano de divisão celular, estabelecendo a organização celular canônica dos entrenós e, consequentemente, promovendo a especificação dos entrenós no SAM.
O meristema apical caulinar (MAC), localizado no ápice caulinar, contém um nicho de células-tronco cuja atividade gera órgãos laterais e nós caulinares de forma modular e iterativa ao longo da vida da planta. Cada uma dessas unidades repetitivas, ou nós da planta, inclui entrenós e órgãos laterais nos nós, e meristemas axilares nas axilas das folhas¹. O crescimento e a organização dos nós da planta mudam durante o desenvolvimento. Em Arabidopsis, o crescimento internodal é suprimido durante a fase vegetativa, e os meristemas axilares permanecem dormentes nas axilas das folhas da roseta. Durante a transição para a fase floral, o MAC torna-se o meristema da inflorescência, gerando entrenós alongados e gemas axilares, râmulos nas axilas das folhas caulinares e, posteriormente, flores sem folhas². Embora tenhamos feito progressos significativos na compreensão dos mecanismos que controlam a iniciação de folhas, flores e ramos, relativamente pouco se sabe sobre como os entrenós se originam.
Compreender a distribuição espaço-temporal dos GAs ajudará a entender melhor as funções desses hormônios em diferentes tecidos e em diferentes estágios de desenvolvimento. A visualização da degradação da fusão RGA-GFP, expressa sob a ação de seu próprio promotor, fornece informações importantes sobre a regulação dos níveis totais de GA nas raízes15,16. No entanto, a expressão de RGA varia entre os tecidos17 e é regulada por GA18. Assim, a expressão diferencial do promotor de RGA pode resultar no padrão de fluorescência observado com RGA-GFP e, portanto, esse método não é quantitativo. Mais recentemente, GA bioativo marcado com fluoresceína (Fl)19,20 revelou o acúmulo de GA no endocórtex da raiz e a regulação de seus níveis celulares pelo transporte de GA. Recentemente, o sensor FRET de GA nlsGPS1 mostrou que os níveis de GA se correlacionam com o alongamento celular em raízes, filamentos e hipocótilos cultivados no escuro21. Contudo, como vimos, a concentração de GA não é o único parâmetro que controla a atividade de sinalização de GA, pois depende de processos de detecção complexos. Neste trabalho, com base em nossa compreensão das vias de sinalização DELLA e GA, relatamos o desenvolvimento e a caracterização de um biossensor ratiométrico baseado na degradação para a sinalização de GA. Para desenvolver este biossensor quantitativo, utilizamos uma RGA mutante sensível a GA, fusionada a uma proteína fluorescente e expressa ubiquamente nos tecidos, bem como uma proteína fluorescente insensível a GA. Demonstramos que as fusões da proteína RGA mutante não interferem na sinalização endógena de GA quando expressas ubiquamente, e que este biossensor pode quantificar a atividade de sinalização resultante tanto da entrada de GA quanto do processamento do sinal de GA pelo aparato sensorial com alta resolução espaço-temporal. Utilizamos este biossensor para mapear a distribuição espaço-temporal da atividade de sinalização de GA e quantificar como o GA regula o comportamento celular na epiderme do meristema apical caulinar (SAM). Demonstramos que o GA regula a orientação do plano de divisão das células do SAM localizadas entre os primórdios dos órgãos, definindo assim a organização celular canônica do internódio.
Por fim, investigamos se o qmRGA poderia detectar alterações nos níveis endógenos de GA utilizando hipocótilos em crescimento. Anteriormente, demonstramos que o nitrato estimula o crescimento aumentando a síntese de GA e, consequentemente, a degradação de DELLA34. De acordo com isso, observamos que o comprimento do hipocótilo em plântulas pUBQ10::qmRGA cultivadas sob suprimento abundante de nitrato (10 mM NO3−) foi significativamente maior do que em plântulas cultivadas em condições de deficiência de nitrato (Figura Suplementar 6a). Em consonância com a resposta de crescimento, os sinais de GA foram mais intensos nos hipocótilos de plântulas cultivadas em condições de 10 mM NO3− do que em plântulas cultivadas na ausência de nitrato (Figura Suplementar 6b, c). Assim, o qmRGA também permite o monitoramento de alterações na sinalização de GA induzidas por mudanças endógenas na concentração de GA.
Para entender se a atividade de sinalização do GA detectada pelo qmRGA depende da concentração e da percepção do GA, como esperado com base no projeto do sensor, analisamos a expressão dos três receptores GID1 em tecidos vegetativos e reprodutivos. Em plântulas, a linha repórter GID1-GUS mostrou que GID1a e c foram altamente expressos nos cotilédones (Fig. 3a–c). Além disso, todos os três receptores foram expressos em folhas, primórdios de raízes laterais, ápices radiculares (exceto na coifa radicular de GID1b) e no sistema vascular (Fig. 3a–c). No meristema apical caulinar (MAC) da inflorescência, detectamos sinais de GUS apenas para GID1b e 1c (Fig. suplementar 7a–c). A hibridização in situ confirmou esses padrões de expressão e demonstrou ainda que GID1c foi uniformemente expresso em baixos níveis no MAC, enquanto GID1b apresentou maior expressão na periferia do MAC (Fig. suplementar 7d–l). A fusão translacional pGID1b::2xmTQ2-GID1b também revelou uma variação gradual na expressão de GID1b, desde baixa ou nenhuma expressão no centro do SAM até alta expressão nas bordas do órgão (Figura Suplementar 7m). Assim, os receptores GID1 não estão distribuídos uniformemente entre e dentro dos tecidos. Em experimentos subsequentes, também observamos que a superexpressão de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) aumentou a sensibilidade de qmRGA em hipocótilos à aplicação externa de GA (Fig. 3d, e). Em contraste, a fluorescência medida por qd17mRGA no hipocótilo foi insensível ao tratamento com GA3 (Fig. 3f, g). Para ambos os ensaios, as plântulas foram tratadas com altas concentrações de GA (100 μM GA3) para avaliar o comportamento rápido do sensor, onde a capacidade de ligação ao receptor GID1 foi aumentada ou perdida. Em conjunto, esses resultados confirmam que o biossensor qmRGA desempenha uma função combinada como sensor de GA e GA, e sugerem que a expressão diferencial do receptor GID1 pode modular significativamente a emissividade do sensor.
Até o momento, a distribuição dos sinais de GA no SAM permanece incerta. Portanto, utilizamos plantas que expressam qmRGA e o repórter de células-tronco pCLV3::mCherry-NLS35 para calcular mapas quantitativos de alta resolução da atividade de sinalização de GA, com foco na camada L1 (epiderme; Fig. 4a, b, ver Métodos e Métodos Suplementares), visto que L1 desempenha um papel fundamental no controle do crescimento do SAM36. Aqui, a expressão de pCLV3::mCherry-NLS forneceu um ponto de referência geométrico fixo para analisar a distribuição espaço-temporal da atividade de sinalização de GA37. Embora o GA seja considerado essencial para o desenvolvimento de órgãos laterais4, observamos que os sinais de GA foram baixos no primórdio floral (P) a partir do estágio P3 (Fig. 4a, b), enquanto os primórdios jovens P1 e P2 apresentaram atividade moderada, semelhante à da região central (Fig. 4a, b). Uma maior atividade de sinalização de GA foi detectada nos limites dos primórdios dos órgãos, começando em P1/P2 (nas laterais do limite) e atingindo o pico em P4, bem como em todas as células da região periférica localizada entre os primórdios (Fig. 4a, b e Fig. Suplementar 8a, b). Essa maior atividade de sinalização de GA foi observada não apenas na epiderme, mas também nas camadas L2 e L3 superior (Fig. Suplementar 8b). O padrão de sinais de GA detectado no SAM usando qmRGA também permaneceu inalterado ao longo do tempo (Fig. Suplementar 8c–f, k). Embora a construção qd17mRGA tenha sido sistematicamente regulada negativamente no SAM de plantas T3 de cinco linhagens independentes que caracterizamos em detalhes, conseguimos analisar os padrões de fluorescência obtidos com a construção pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. Suplementar 8g–j, l). Nessa linha de controle, apenas pequenas alterações na razão de fluorescência foram detectadas no SAM, mas no centro do SAM observamos uma diminuição clara e inesperada de VENUS associada a TagBFP. Isso confirma que o padrão de sinalização observado por qmRGA reflete a degradação dependente de GA de mRGA-VENUS, mas também demonstra que qmRGA pode superestimar a atividade de sinalização de GA no centro do meristema. Em resumo, nossos resultados revelam um padrão de sinalização de GA que reflete principalmente a distribuição dos primórdios. Essa distribuição da região interprimordial (IPR) deve-se ao estabelecimento gradual de alta atividade de sinalização de GA entre o primórdio em desenvolvimento e a região central, enquanto, ao mesmo tempo, a atividade de sinalização de GA no primórdio diminui (Fig. 4c, d).
A distribuição dos receptores GID1b e GID1c (ver acima) sugere que a expressão diferencial dos receptores de GA ajuda a moldar o padrão de atividade de sinalização de GA no SAM. Questionamo-nos se o acúmulo diferencial de GA poderia estar envolvido. Para investigar essa possibilidade, utilizamos o sensor FRET de GA nlsGPS121. Um aumento na frequência de ativação foi detectado no SAM de nlsGPS1 tratado com 10 μM de GA4+7 por 100 min (Figura Suplementar 9a–e), indicando que nlsGPS1 responde a alterações na concentração de GA no SAM, assim como ocorre nas raízes21. A distribuição espacial da frequência de ativação de nlsGPS1 revelou níveis relativamente baixos de GA nas camadas externas do SAM, mas mostrou que esses níveis estavam elevados no centro e nas bordas do SAM (Figura 4e e Figura Suplementar 9a,c). Isso sugere que o GA também se distribui no SAM com um padrão espacial comparável ao revelado por qmRGA. Como abordagem complementar, também tratamos o SAM com GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ou apenas com Fl como controle negativo. O sinal de Fl foi distribuído por todo o SAM, incluindo a região central e o primórdio, embora com menor intensidade (Fig. 4j e Fig. Suplementar 10d). Em contraste, os três GA-Fl se acumularam especificamente nas bordas do primórdio e, em diferentes graus, no restante do IPR, com o GA7-Fl se acumulando no maior domínio do IPR (Fig. 4k e Fig. Suplementar 10a,b). A quantificação da intensidade de fluorescência revelou que a razão entre a intensidade do IPR e a intensidade fora do IPR foi maior no SAM tratado com GA-Fl em comparação com o SAM tratado com Fl (Fig. 4l e Fig. Suplementar 10c). Juntos, esses resultados sugerem que o GA está presente em concentrações mais altas nas células do IPR localizadas mais próximas da borda do órgão. Isso sugere que o padrão de atividade de sinalização de GA no SAM resulta tanto da expressão diferencial de receptores de GA quanto do acúmulo diferencial de GA em células IPR próximas às bordas do órgão. Assim, nossa análise revelou um padrão espaço-temporal inesperado de sinalização de GA, com menor atividade no centro e primórdio do SAM e maior atividade no IPR na região periférica.
Para compreender o papel da atividade diferencial de sinalização do GA no SAM, analisamos a correlação entre a atividade de sinalização do GA, a expansão celular e a divisão celular usando imagens time-lapse em tempo real do SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Dado o papel do GA na regulação do crescimento, esperava-se uma correlação positiva com os parâmetros de expansão celular. Portanto, comparamos inicialmente os mapas de atividade de sinalização do GA com mapas da taxa de crescimento da superfície celular (como um indicador da intensidade da expansão celular para uma determinada célula e para as células-filhas em divisão) e com mapas de anisotropia de crescimento, que mede a direcionalidade da expansão celular (também usada aqui para uma determinada célula e para as células-filhas em divisão; Fig. 5a,b, ver Métodos e Métodos Suplementares). Nossos mapas da taxa de crescimento da superfície celular do SAM são consistentes com observações anteriores38,39, com taxas de crescimento mínimas na borda e taxas de crescimento máximas em flores em desenvolvimento (Fig. 5a). A análise de componentes principais (PCA) mostrou que a atividade de sinalização do GA estava negativamente correlacionada com a intensidade do crescimento da superfície celular (Figura 5c). Também demonstramos que os principais eixos de variação, incluindo a sinalização de GA e a intensidade de crescimento, eram ortogonais à direção determinada pela alta expressão de CLV3, confirmando a exclusão de células do centro do SAM nas análises subsequentes. A análise de correlação de Spearman confirmou os resultados da PCA (Figura 5d), indicando que sinais de GA mais intensos no IPR não resultaram em maior expansão celular. No entanto, a análise de correlação revelou uma leve correlação positiva entre a atividade de sinalização de GA e a anisotropia de crescimento (Figura 5c, d), sugerindo que uma sinalização de GA mais intensa no IPR influencia a direção do crescimento celular e possivelmente a posição do plano de divisão celular.
a, b Mapas de calor do crescimento superficial médio (a) e da anisotropia do crescimento (b) no SAM, com média calculada a partir de sete plantas independentes (usadas como indicadores da intensidade e direção da expansão celular, respectivamente). c A análise de componentes principais (PCA) incluiu as seguintes variáveis: sinal de GA, intensidade do crescimento superficial, anisotropia do crescimento superficial e expressão de CLV3. O componente 1 da PCA apresentou correlação negativa com a intensidade do crescimento superficial e correlação positiva com o sinal de GA. O componente 2 da PCA apresentou correlação positiva com a anisotropia do crescimento superficial e correlação negativa com a expressão de CLV3. As porcentagens representam a variação explicada por cada componente. d Análise de correlação de Spearman entre o sinal de GA, a intensidade do crescimento superficial e a anisotropia do crescimento superficial em escala tecidual, excluindo a zona crítica (ZC). O número à direita representa o valor de rho de Spearman entre as duas variáveis. Os asteriscos indicam casos em que a correlação/correlação negativa é altamente significativa. e Visualização 3D de células L1 do SAM de Col-0 por microscopia confocal. As novas paredes celulares formadas no SAM (mas não no primórdio) em 10 h são coloridas de acordo com seus valores angulares. A barra de cores é mostrada no canto inferior direito. A imagem inserida mostra a imagem 3D correspondente em 0 h. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. f Os diagramas de caixa exibem as taxas de divisão celular no SAM de Col-0 com e sem IPR (n = 10 plantas independentes). A linha central mostra a mediana e os limites da caixa indicam os percentis 25 e 75. As linhas indicam os valores mínimo e máximo determinados com o software R. Os valores de p foram obtidos com o teste t de Welch bicaudal. g, h Diagrama esquemático mostrando (g) como medir o ângulo da nova parede celular (magenta) em relação à direção radial a partir do centro do SAM (linha pontilhada branca) (apenas valores de ângulo agudo, ou seja, 0–90°, são considerados) e (h) as direções circunferencial/lateral e radial dentro do meristema. i. Histogramas de frequência da orientação do plano de divisão celular ao longo do SAM (azul escuro), IPR (azul médio) e fora do IPR (azul claro), respectivamente. Os valores de p foram obtidos por um teste de Kolmogorov-Smirnov bicaudal. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. j. Histogramas de frequência da orientação do plano de divisão celular do IPR em torno de P3 (verde claro), P4 (verde médio) e P5 (verde escuro), respectivamente. Os valores de p foram obtidos por um teste de Kolmogorov-Smirnov bicaudal. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes.
Portanto, em seguida, investigamos a correlação entre a sinalização de GA e a atividade de divisão celular, identificando paredes celulares recém-formadas durante o ensaio (Fig. 5e). Essa abordagem nos permitiu medir a frequência e a direção da divisão celular. Surpreendentemente, descobrimos que a frequência de divisões celulares no IPR e no restante do SAM (não-IPR, Fig. 5f) era semelhante, indicando que as diferenças na sinalização de GA entre as células IPR e não-IPR não afetam significativamente a divisão celular. Isso, juntamente com a correlação positiva entre a sinalização de GA e a anisotropia de crescimento, nos levou a considerar se a atividade de sinalização de GA poderia influenciar a orientação do plano de divisão celular. Medimos a orientação da nova parede celular como um ângulo agudo em relação ao eixo radial que conecta o centro do meristema ao centro da nova parede celular (Fig. 5e-i) e observamos uma clara tendência de as células se dividirem em ângulos próximos a 90° em relação ao eixo radial, com as maiores frequências observadas em 70–80° (23,28%) e 80–90° (22,62%) (Fig. 5e,i), correspondendo a divisões celulares na direção circunferencial/transversal (Fig. 5h). Para examinar a contribuição da sinalização de GA para esse comportamento de divisão celular, analisamos os parâmetros de divisão celular no IPR e fora do IPR separadamente (Fig. 5i). Observamos que a distribuição do ângulo de divisão nas células IPR diferiu daquela nas células não-IPR ou nas células em todo o SAM, com as células IPR exibindo uma proporção maior de divisões celulares laterais/circulares, ou seja, 70–80° e 80–90° (33,86% e 30,71%, respectivamente, proporções correspondentes) (Fig. 5i). Assim, nossas observações revelaram uma associação entre alta sinalização de GA e uma orientação do plano de divisão celular próxima à direção circunferencial, semelhante à correlação entre a atividade de sinalização de GA e a anisotropia do crescimento (Fig. 5c, d). Para estabelecer ainda mais a conservação espacial dessa associação, medimos a orientação do plano de divisão nas células IPR ao redor do primórdio a partir de P3, visto que a maior atividade de sinalização de GA foi detectada nessa região a partir de P4 (Fig. 4). Os ângulos de divisão das células IPR em torno de P3 e P4 não mostraram diferenças estatisticamente significativas, embora uma frequência aumentada de divisões celulares laterais tenha sido observada nas células IPR em torno de P4 (Fig. 5j). Entretanto, nas células IPR em torno de P5, a diferença na orientação do plano de divisão celular tornou-se estatisticamente significativa, com um aumento acentuado na frequência de divisões celulares transversais (Fig. 5j). Juntos, esses resultados sugerem que a sinalização de GA pode controlar a orientação das divisões celulares no SAM, o que é consistente com relatos anteriores40,41 de que a alta sinalização de GA pode induzir a orientação lateral das divisões celulares no IPR.
Prevê-se que as células na IPR não sejam incorporadas aos primórdios, mas sim aos internódios2,42,43. A orientação transversal das divisões celulares na IPR pode resultar na organização típica de fileiras longitudinais paralelas de células epidérmicas nos internódios. Nossas observações descritas acima sugerem que a sinalização do GA provavelmente desempenha um papel nesse processo, regulando a direção da divisão celular.
A perda de função de vários genes DELLA resulta em uma resposta constitutiva ao GA, e mutantes della podem ser usados para testar essa hipótese44. Inicialmente, analisamos os padrões de expressão de cinco genes DELLA no SAM. A fusão transcricional da linhagem GUS45 revelou que GAI, RGA, RGL1 e RGL2 (em menor grau) foram expressos no SAM (Figura Suplementar 11a–d). A hibridização in situ demonstrou ainda que o mRNA de GAI se acumula especificamente em primórdios e flores em desenvolvimento (Figura Suplementar 11e). Os mRNAs de RGL1 e RGL3 foram detectados em toda a copa do SAM e em flores mais velhas, enquanto o mRNA de RGL2 foi mais abundante na região da borda (Figura Suplementar 11f–h). A microscopia confocal do SAM pRGL3::RGL3-GFP confirmou a expressão observada pela hibridização in situ e mostrou que a proteína RGL3 se acumula na parte central do SAM (Figura Suplementar 11i). Usando a linhagem pRGA::GFP-RGA, também descobrimos que a proteína RGA se acumula no SAM, mas sua abundância diminui na borda a partir de P4 (Figura Suplementar 11j). Notavelmente, os padrões de expressão de RGL3 e RGA são consistentes com uma maior atividade de sinalização de GA no IPR, conforme detectado por qmRGA (Figura 4). Além disso, esses dados indicam que todos os DELLAs são expressos no SAM e que sua expressão, coletivamente, abrange todo o SAM.
Em seguida, analisamos os parâmetros de divisão celular no SAM do tipo selvagem (Ler, controle) e nos mutantes quíntuplos (globais) gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della (Fig. 6a, b). Curiosamente, observamos uma mudança estatisticamente significativa na distribuição das frequências dos ângulos de divisão celular no SAM do mutante global della em comparação com o tipo selvagem (Fig. 6c). Essa mudança no mutante global della foi devida a um aumento na frequência de ângulos de 80–90° (34,71% vs. 24,55%) e, em menor grau, de ângulos de 70–80° (23,78% vs. 20,18%), ou seja, correspondentes a divisões celulares transversais (Fig. 6c). A frequência de divisões não transversais (0–60°) também foi menor no mutante global della (Fig. 6c). A frequência de divisões celulares transversais aumentou significativamente no SAM do mutante global della (Fig. 6b). A frequência de divisões celulares transversais no IPR também foi maior no mutante global della em comparação com o tipo selvagem (Fig. 6d). Fora da região do IPR, o tipo selvagem apresentou uma distribuição mais uniforme dos ângulos de divisão celular, enquanto o mutante global della preferiu divisões tangenciais, como no IPR (Fig. 6e). Também quantificamos a orientação das divisões celulares no SAM de mutantes quíntuplos da oxidase ga2 (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 e ga2ox6-2), um contexto mutante inativo para GA no qual o GA se acumula. Em consonância com o aumento nos níveis de GA, o SAM da inflorescência do mutante quíntuplo ga2ox foi maior do que o de Col-0 (Figura Suplementar 12a, b) e, em comparação com Col-0, o SAM do mutante quíntuplo ga2ox apresentou uma distribuição distintamente diferente dos ângulos de divisão celular, com a frequência angular aumentando de 50° para 90°, ou seja, favorecendo novamente as divisões tangenciais (Figura Suplementar 12a–c). Assim, demonstramos que a ativação constitutiva da sinalização de GA e o acúmulo de GA induzem divisões celulares laterais no IPR e no restante do SAM.
a, b Visualização 3D da camada L1 do SAM corado com PI de Ler (a) e do mutante global della (b) usando microscopia confocal. Novas paredes celulares formadas no SAM (mas não no primórdio) ao longo de um período de 10 h são mostradas e coloridas de acordo com seus valores de ângulo. A imagem inserida mostra o SAM em 0 h. A barra de cores é exibida no canto inferior direito. A seta em (b) aponta para um exemplo de fileiras de células alinhadas no mutante global della. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. c Comparação da distribuição de frequência das orientações do plano de divisão celular em todo o SAM (d), IPR (e) e não-IPR (f) entre Ler e o mutante global della. Os valores de p foram obtidos usando um teste de Kolmogorov-Smirnov bicaudal. f, g Visualização 3D de imagens confocais do SAM corado com PI de plantas transgênicas Col-0 (i) e pCUC2::gai-1-VENUS (j). Os painéis (a, b) mostram novas paredes celulares (mas não primórdios) formadas no SAM em 10 h. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. h–j Comparação da distribuição de frequência das orientações do plano de divisão celular localizadas em todo o SAM (h), IPR (i) e fora do IPR (j) entre plantas Col-0 e pCUC2::gai-1-VENUS. Os valores de P foram obtidos usando um teste de Kolmogorov-Smirnov bicaudal.
Em seguida, testamos o efeito da inibição da sinalização de GA especificamente no IPR. Para isso, utilizamos o promotor do cotilédone cup 2 (CUC2) para direcionar a expressão de uma proteína gai-1 dominante negativa fusionada a VENUS (na linhagem pCUC2::gai-1-VENUS). No SAM do tipo selvagem, o promotor CUC2 direciona a expressão da maioria dos IPRs no SAM, incluindo as células da borda, a partir de P4, e uma expressão específica semelhante foi observada em plantas pCUC2::gai-1-VENUS (veja abaixo). A distribuição dos ângulos de divisão celular ao longo do SAM ou IPR das plantas pCUC2::gai-1-VENUS não foi significativamente diferente daquela do tipo selvagem, embora, inesperadamente, tenhamos observado que as células sem IPR nessas plantas se dividiram com uma frequência maior de 80–90° (Fig. 6f–j).
Foi sugerido que a direção da divisão celular depende da geometria do SAM, em particular da tensão gerada pela curvatura do tecido46. Portanto, questionamos se a forma do SAM estava alterada no mutante global della e nas plantas pCUC2::gai-1-VENUS. Como relatado anteriormente12, o tamanho do SAM do mutante global della era maior do que o do tipo selvagem (Figura Suplementar 13a, b, d). A hibridização in situ de RNA CLV3 e STM confirmou a expansão do meristema nos mutantes della e mostrou ainda a expansão lateral do nicho de células-tronco (Figura Suplementar 13e, f, h, i). No entanto, a curvatura do SAM foi semelhante em ambos os genótipos (Figura Suplementar 13k, m, n, p). Observamos um aumento semelhante no tamanho do mutante quádruplo gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della, sem alteração na curvatura em comparação com o tipo selvagem (Figura Suplementar 13c, d, g, j, l, o, p). A frequência da orientação da divisão celular também foi afetada no mutante quádruplo della, mas em menor grau do que no mutante monolítico della (Figura Suplementar 12d–f). Esse efeito de dosagem, juntamente com a ausência de efeito na curvatura, sugere que a atividade residual de RGL3 no mutante quádruplo de Della limita as alterações na orientação da divisão celular causadas pela perda da atividade de DELLA e que as alterações nas divisões celulares laterais ocorrem em resposta a mudanças na atividade de sinalização de GA, e não a mudanças na geometria do SAM. Conforme descrito acima, o promotor CUC2 direciona a expressão de IPR no SAM a partir de P4 (Figura Suplementar 14a, b) e, em contraste, o SAM pCUC2::gai-1-VENUS apresentou tamanho reduzido, porém maior curvatura (Figura Suplementar 14c–h). Essa alteração na morfologia do SAM pCUC2::gai-1-VENUS pode resultar em uma distribuição diferente de tensões mecânicas em comparação com o tipo selvagem, no qual altas tensões circunferenciais começam a uma distância menor do centro do SAM47. Alternativamente, as alterações na morfologia do SAM pCUC2::gai-1-VENUS podem resultar de mudanças nas propriedades mecânicas regionais induzidas pela expressão do transgene48. Em ambos os casos, isso poderia compensar parcialmente os efeitos das alterações na sinalização de GA, aumentando a probabilidade de as células se dividirem na orientação circunferencial/transversal, o que explica nossas observações.
Em conjunto, nossos dados confirmam que uma maior sinalização de GA desempenha um papel ativo na orientação lateral do plano de divisão celular no IPR. Eles também mostram que a curvatura do meristema influencia a orientação do plano de divisão celular no IPR.
A orientação transversal do plano de divisão no IPR, devido à alta atividade de sinalização do GA, sugere que o GA pré-organiza uma fileira radial de células na epiderme dentro do SAM para definir a organização celular que será posteriormente encontrada no entrenó epidérmico. De fato, tais fileiras de células foram frequentemente visíveis em imagens do SAM de mutantes globais della (Fig. 6b). Assim, para explorar ainda mais a função do padrão espacial de sinalização do GA no SAM durante o desenvolvimento, utilizamos imagens de lapso de tempo para analisar a organização espacial das células no IPR em plantas do tipo selvagem (Ler e Col-0), mutantes globais della e plantas transgênicas pCUC2::gai-1-VENUS.
Descobrimos que o qmRGA mostrou que a atividade de sinalização de GA no IPR aumentou de P1/P2 e atingiu o pico em P4, e esse padrão permaneceu constante ao longo do tempo (Fig. 4a–f e Fig. Suplementar 8c–f, k). Para analisar a organização espacial das células no IPR com o aumento do sinal de GA, marcamos as células Ler do IPR acima e nas laterais de P4 de acordo com seu destino de desenvolvimento, analisado 34 h após a primeira observação, ou seja, mais de dois tempos de plastídeo, permitindo-nos acompanhar as células do IPR durante o desenvolvimento do primórdio de P1/P2 a P4. Usamos três cores diferentes: amarelo para as células que se integraram ao primórdio próximo a P4, verde para as que estavam no IPR e roxo para as que participaram de ambos os processos (Fig. 7a–c). Em t0 (0 h), 1–2 camadas de células do IPR eram visíveis em frente a P4 (Fig. 7a). Como esperado, quando essas células se dividiram, fizeram-no principalmente através do plano de divisão transversal (Figs. 7a–c). Resultados semelhantes foram obtidos usando o SAM de Col-0 (com foco em P3, cuja borda se dobra de forma similar a P4 em Ler), embora nesse genótipo a dobra formada na borda floral tenha ocultado as células IPR mais rapidamente (Fig. 7g–i). Assim, o padrão de divisão das células IPR pré-organiza as células em fileiras radiais, como nos entrenós. A organização das fileiras radiais e a localização das células IPR entre órgãos sucessivos sugerem que essas células são progenitoras internodais.
Aqui, desenvolvemos um biossensor ratiométrico de sinalização de GA, o qmRGA, que permite o mapeamento quantitativo da atividade de sinalização de GA resultante das concentrações combinadas de GA e do receptor de GA, minimizando a interferência com as vias de sinalização endógenas e, assim, fornecendo informações sobre a função do GA em nível celular. Para isso, construímos uma proteína DELLA modificada, a mRGA, que perdeu a capacidade de se ligar aos parceiros de interação da DELLA, mas permanece sensível à proteólise induzida por GA. O qmRGA responde a alterações exógenas e endógenas nos níveis de GA, e suas propriedades de detecção dinâmica permitem a avaliação de mudanças espaço-temporais na atividade de sinalização de GA durante o desenvolvimento. O qmRGA também é uma ferramenta muito flexível, pois pode ser adaptado a diferentes tecidos alterando-se o promotor usado para sua expressão (se necessário) e, dada a natureza conservada da via de sinalização de GA e do motivo PFYRE em angiospermas, é provável que seja transferível para outras espécies. Em consonância com isso, uma mutação equivalente na proteína DELLA SLR1 do arroz (HYY497AAA) também demonstrou suprimir a atividade repressora do crescimento de SLR1, reduzindo apenas ligeiramente sua degradação mediada por GA, similar ao mRGA23. Notavelmente, estudos recentes em Arabidopsis mostraram que uma única mutação de aminoácido no domínio PFYRE (S474L) alterou a atividade transcricional de RGA sem afetar sua capacidade de interagir com fatores de transcrição parceiros50. Embora essa mutação seja muito próxima das 3 substituições de aminoácidos presentes no mRGA, nossos estudos mostram que essas duas mutações alteram características distintas de DELLA. Embora a maioria dos fatores de transcrição parceiros se ligue aos domínios LHR1 e SAW de DELLA26,51, alguns aminoácidos conservados no domínio PFYRE podem ajudar a estabilizar essas interações.
O desenvolvimento do entrenó é uma característica fundamental na arquitetura da planta e no aumento da produtividade. A análise qmRGA revelou maior atividade de sinalização do GA em células progenitoras do entrenó do IPR. Combinando imagens quantitativas e genética, demonstramos que os padrões de sinalização do GA sobrepõem planos de divisão celular circulares/transversais na epiderme do SAM, moldando a organização da divisão celular necessária para o desenvolvimento do entrenó. Diversos reguladores da orientação do plano de divisão celular foram identificados durante o desenvolvimento52,53. Nosso trabalho fornece um exemplo claro de como a atividade de sinalização do GA regula esse parâmetro celular. A proteína DELLA pode interagir com complexos de proteínas de pré-dobramento41, portanto, a sinalização do GA pode regular a orientação do plano de divisão celular influenciando diretamente a orientação dos microtúbulos corticais40,41,54,55. Inesperadamente, demonstramos que, no SAM, o correlato da maior atividade de sinalização do GA não foi o alongamento ou a divisão celular, mas apenas a anisotropia de crescimento, o que é consistente com um efeito direto do GA na direção da divisão celular no IPR. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de que esse efeito também seja indireto, por exemplo, mediado pelo amolecimento da parede celular induzido por GA56. Alterações nas propriedades da parede celular induzem estresse mecânico57,58, que também pode influenciar a orientação do plano de divisão celular, afetando a orientação dos microtúbulos corticais39,46,59. Os efeitos combinados do estresse mecânico induzido por GA e da regulação direta da orientação dos microtúbulos por GA podem estar envolvidos na geração de um padrão específico de orientação da divisão celular no IPR para definir os internódios, e mais estudos são necessários para testar essa hipótese. De forma semelhante, estudos anteriores destacaram a importância das proteínas TCP14 e 15, que interagem com DELLA, no controle da formação dos internódios60,61, e esses fatores podem mediar a ação do GA juntamente com BREVIPEDICELLUS (BP) e PENNYWISE (PNY), que regulam o desenvolvimento dos internódios e demonstraram influenciar a sinalização do GA2,62. Dado que as DELLAs interagem com as vias de sinalização do brassinosteróide, etileno, ácido jasmônico e ácido abscísico (ABA)63,64 e que esses hormônios podem influenciar a orientação dos microtúbulos65, os efeitos do GA na orientação da divisão celular também podem ser mediados por outros hormônios.
Estudos citológicos iniciais mostraram que tanto as regiões internas quanto externas do SAM de Arabidopsis são necessárias para o desenvolvimento dos entrenós2,42. O fato de o GA regular ativamente a divisão celular nos tecidos internos12 corrobora a dupla função do GA na regulação do tamanho do meristema e do entrenó no SAM. O padrão de divisão celular direcional também é rigorosamente regulado no tecido interno do SAM, e essa regulação é essencial para o crescimento do caule52. Será interessante examinar se o GA também desempenha um papel na orientação do plano de divisão celular na organização interna do SAM, sincronizando assim a especificação e o desenvolvimento dos entrenós dentro do SAM.
As plantas foram cultivadas in vitro em solo ou em meio Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) suplementado com 1% de sacarose e 1% de ágar (Sigma) em condições padrão (16 h de luz, 22 °C), exceto para os experimentos de crescimento de hipocótilo e raiz, nos quais as plântulas foram cultivadas em placas verticais sob luz constante e 22 °C. Para os experimentos com nitrato, as plantas foram cultivadas em meio MS modificado (meio para plantas bioWORLD) suplementado com nitrato adequado (0 ou 10 mM de KNO3), 0,5 mM de succinato de amônio, 1% de sacarose e 1% de ágar A (Sigma) em condições de fotoperíodo longo.
O cDNA de GID1a inserido em pDONR221 foi recombinado com pDONR P4-P1R-pUBQ10 e pDONR P2R-P3-mCherry em pB7m34GW para gerar pUBQ10::GID1a-mCherry. O DNA de IDD2 inserido em pDONR221 foi recombinado em pB7RWG266 para gerar p35S:IDD2-RFP. Para gerar pGID1b::2xmTQ2-GID1b, um fragmento de 3,9 kb a montante da região codificadora de GID1b e um fragmento de 4,7 kb contendo o cDNA de GID1b (1,3 kb) e o terminador (3,4 kb) foram amplificados usando os primers na Tabela Suplementar 3 e, em seguida, inseridos em pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) e pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respectivamente, e finalmente recombinados com pDONR221 2xmTQ268 no vetor alvo pGreen 012567 usando clonagem Gateway. Para gerar o pCUC2::LSSmOrange, a sequência promotora de CUC2 (3229 pb a montante do ATG), seguida pela sequência codificadora do grande mOrange deslocado por Stokes (LSSmOrange)69 com o sinal de localização nuclear N7 e o terminador transcricional NOS, foi montada no vetor de direcionamento à canamicina pGreen usando o sistema de recombinação de fragmentos Gateway 3 (Invitrogen). O vetor binário para plantas foi introduzido na cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens e em folhas de Nicotiana benthamiana pelo método de infiltração com Agrobacterium e em Arabidopsis thaliana Col-0 pelo método de imersão floral. Os plasmídeos pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry e pCLV3::mCherry-NLS qmRGA foram isolados das progênies F3 e F1 dos respectivos cruzamentos.
A hibridização in situ de RNA foi realizada em ápices caulinares de aproximadamente 1 cm de comprimento72, os quais foram coletados e imediatamente fixados em solução FAA (3,7% de formaldeído, 5% de ácido acético, 50% de etanol) pré-resfriada a 4 °C. Após 2 tratamentos a vácuo de 15 min, o fixador foi trocado e as amostras foram incubadas durante a noite. Os cDNAs de GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 e RGL3 e as sondas antisense para suas 3′-UTRs foram sintetizados usando os primers mostrados na Tabela Suplementar 3, conforme descrito por Rosier et al.73. As sondas marcadas com digoxigenina foram imunodetectadas usando anticorpos anti-digoxigenina (diluição de 3000 vezes; Roche, número de catálogo: 11 093 274 910), e as secções foram coradas com solução de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP, diluição de 250 vezes)/nitroblue tetrazolium (NBT, diluição de 200 vezes).
Data da publicação: 10 de fevereiro de 2025