O crescimento do meristema apical do caule (MAC) é fundamental para a arquitetura do caule. Hormônios vegetaisgiberelinas(GAs) desempenham papéis-chave na coordenação do crescimento vegetal, mas seu papel no SAM permanece pouco compreendido. Aqui, desenvolvemos um biossensor raciométrico de sinalização de GA, projetando a proteína DELLA para suprimir sua função regulatória essencial na resposta transcricional de GA, preservando sua degradação após o reconhecimento de GA. Demonstramos que esse biossensor baseado em degradação registra com precisão as mudanças nos níveis de GA e na detecção celular durante o desenvolvimento. Usamos esse biossensor para mapear a atividade de sinalização de GA no SAM. Mostramos que altos sinais de GA estão presentes predominantemente em células localizadas entre primórdios de órgãos, que são precursores de células de internódios. Usando abordagens de ganho e perda de função, demonstramos ainda que o GA regula a orientação do plano de divisão celular, estabelecendo a organização celular canônica dos internódios, promovendo assim a especificação de internódios no SAM.
O meristema apical do caule (MAC), localizado no ápice do caule, contém um nicho de células-tronco cuja atividade gera órgãos laterais e nós caulinares de maneira modular e iterativa ao longo da vida da planta. Cada uma dessas unidades repetitivas, ou nós da planta, inclui internódios e órgãos laterais nos nós, e meristemas axilares nas axilas das folhas1. O crescimento e a organização dos nós da planta mudam durante o desenvolvimento. Em Arabidopsis, o crescimento internodal é suprimido durante o estágio vegetativo, e os meristemas axilares permanecem dormentes nas axilas das folhas em roseta. Durante a transição para a fase floral, o MAC se torna o meristema da inflorescência, gerando internódios alongados e gemas axilares, raminhos nas axilas das folhas caulinares e, posteriormente, flores sem folhas2. Embora tenhamos feito progressos significativos na compreensão dos mecanismos que controlam a iniciação de folhas, flores e ramos, relativamente pouco se sabe sobre como os internódios surgem.
Compreender a distribuição espaço-temporal dos AGs ajudará a compreender melhor as funções desses hormônios em diferentes tecidos e em diferentes estágios de desenvolvimento. A visualização da degradação da fusão RGA-GFP expressa sob a ação de seu próprio promotor fornece informações importantes sobre a regulação dos níveis totais de AG nas raízes15,16. No entanto, a expressão de RGA varia entre os tecidos17 e é regulada por AG18. Assim, a expressão diferencial do promotor de RGA pode resultar no padrão de fluorescência observado com RGA-GFP e, portanto, este método não é quantitativo. Mais recentemente, o AG19,20 marcado com fluoresceína bioativa (Fl) revelou o acúmulo de AG no endocórtex da raiz e a regulação de seus níveis celulares pelo transporte de AG. Recentemente, o sensor FRET de AG nlsGPS1 mostrou que os níveis de AG se correlacionam com o alongamento celular em raízes, filamentos e hipocótilos cultivados no escuro21. No entanto, como vimos, a concentração de AG não é o único parâmetro que controla a atividade de sinalização de AG, pois depende de processos complexos de detecção. Aqui, com base em nossa compreensão das vias de sinalização DELLA e GA, relatamos o desenvolvimento e a caracterização de um biossensor raciométrico baseado em degradação para sinalização de GA. Para desenvolver este biossensor quantitativo, utilizamos uma RGA mutante sensível a GA que foi fundida a uma proteína fluorescente e expressa onipresentemente em tecidos, bem como uma proteína fluorescente insensível a GA. Mostramos que as fusões da proteína RGA mutante não interferem na sinalização endógena de GA quando expressas onipresentemente, e que este biossensor pode quantificar a atividade de sinalização resultante tanto da entrada de GA quanto do processamento do sinal de GA pelo aparelho sensor com alta resolução espaço-temporal. Utilizamos este biossensor para mapear a distribuição espaço-temporal da atividade de sinalização de GA e quantificar como GA regula o comportamento celular na epiderme do SAM. Demonstramos que GA regula a orientação do plano de divisão das células SAM localizadas entre primórdios de órgãos, definindo assim a organização celular canônica do internódio.
Por fim, questionamos se o qmRGA poderia relatar alterações nos níveis endógenos de GA usando hipocótilos em crescimento. Demonstramos anteriormente que o nitrato estimula o crescimento aumentando a síntese de GA e, por sua vez, a degradação de DELLA34. Consequentemente, observamos que o comprimento do hipocótilo em mudas de pUBQ10::qmRGA cultivadas sob suprimento abundante de nitrato (10 mM NO3−) foi significativamente maior do que em mudas cultivadas em condições deficientes em nitrato (Fig. 6a suplementar). Consistente com a resposta de crescimento, os sinais de GA foram maiores em hipocótilos de mudas cultivadas sob condições de 10 mM NO3− do que em mudas cultivadas na ausência de nitrato (Fig. 6b, c suplementares). Assim, o qmRGA também permite o monitoramento de alterações na sinalização de GA induzidas por alterações endógenas na concentração de GA.
Para entender se a atividade de sinalização de GA detectada por qmRGA depende da concentração de GA e da percepção de GA, como esperado com base no design do sensor, analisamos a expressão dos três receptores GID1 em tecidos vegetativos e reprodutivos. Em mudas, a linhagem repórter GID1-GUS mostrou que GID1a e c foram altamente expressos em cotilédones (Fig. 3a-c). Além disso, todos os três receptores foram expressos em folhas, primórdios de raízes laterais, pontas de raízes (exceto pela coifa de GID1b) e no sistema vascular (Fig. 3a-c). No SAM da inflorescência, detectamos sinais de GUS apenas para GID1b e 1c (Fig. 7a-c suplementar). A hibridização in situ confirmou esses padrões de expressão e demonstrou ainda que GID1c foi uniformemente expresso em baixos níveis no SAM, enquanto GID1b apresentou maior expressão na periferia do SAM (Fig. 7d-l suplementar). A fusão translacional pGID1b::2xmTQ2-GID1b também revelou uma variação gradual na expressão de GID1b, desde baixa ou nenhuma expressão no centro do SAM até alta expressão nas bordas do órgão (Fig. Suplementar 7m). Assim, os receptores GID1 não são distribuídos uniformemente pelos tecidos e dentro deles. Em experimentos subsequentes, também observamos que a superexpressão de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) aumentou a sensibilidade de qmRGA em hipocótilos à aplicação externa de GA (Fig. 3d, e). Em contraste, a fluorescência medida por qd17mRGA no hipocótilo foi insensível ao tratamento com GA3 (Fig. 3f, g). Em ambos os ensaios, as mudas foram tratadas com altas concentrações de GA (100 μM de GA3) para avaliar o comportamento rápido do sensor, onde a capacidade de se ligar ao receptor GID1 foi aumentada ou perdida. Juntos, esses resultados confirmam que o biossensor qmRGA desempenha uma função combinada como um sensor GA e GA, e sugerem que a expressão diferencial do receptor GID1 pode modular significativamente a emissividade do sensor.
Até o momento, a distribuição dos sinais de GA no SAM permanece obscura. Portanto, utilizamos plantas que expressam qmRGA e o repórter de células-tronco pCLV3::mCherry-NLS35 para calcular mapas quantitativos de alta resolução da atividade de sinalização de GA, com foco na camada L1 (epiderme; Fig. 4a, b, ver Métodos e Métodos Suplementares), uma vez que L1 desempenha um papel fundamental no controle do crescimento do SAM36. Aqui, a expressão de pCLV3::mCherry-NLS forneceu um ponto de referência geométrico fixo para analisar a distribuição espaço-temporal da atividade de sinalização de GA37. Embora o GA seja considerado essencial para o desenvolvimento de órgãos laterais4, observamos que os sinais de GA foram baixos no primórdio floral (P) a partir do estágio P3 (Fig. 4a, b), enquanto os primórdios jovens P1 e P2 apresentaram atividade moderada semelhante à da região central (Fig. 4a, b). Uma maior atividade de sinalização de GA foi detectada nas bordas dos primórdios dos órgãos, iniciando em P1/P2 (nas laterais da borda) e atingindo o pico em P4, bem como em todas as células da região periférica localizada entre os primórdios (Fig. 4a, b e Fig. Suplementar 8a, b). Essa maior atividade de sinalização de GA foi observada não apenas na epiderme, mas também nas camadas L2 e L3 superior (Fig. Suplementar 8b). O padrão de sinais de GA detectados na SAM usando qmRGA também permaneceu inalterado ao longo do tempo (Fig. Suplementar 8c-f, k). Embora a construção qd17mRGA tenha sido sistematicamente regulada negativamente na SAM de plantas T3 de cinco linhagens independentes que caracterizamos em detalhes, conseguimos analisar os padrões de fluorescência obtidos com a construção pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. Suplementar 8g-j, l). Nesta linha de controle, apenas pequenas alterações na razão de fluorescência foram detectadas no SAM, mas no centro do SAM observamos uma diminuição clara e inesperada em VENUS associada ao TagBFP. Isso confirma que o padrão de sinalização observado por qmRGA reflete a degradação dependente de GA de mRGA-VENUS, mas também demonstra que qmRGA pode superestimar a atividade de sinalização de GA no centro do meristema. Em resumo, nossos resultados revelam um padrão de sinalização de GA que reflete principalmente a distribuição dos primórdios. Essa distribuição da região interprimordial (IPR) se deve ao estabelecimento gradual de alta atividade de sinalização de GA entre o primórdio em desenvolvimento e a região central, enquanto, ao mesmo tempo, a atividade de sinalização de GA no primórdio diminui (Fig. 4c, d).
A distribuição dos receptores GID1b e GID1c (ver acima) sugere que a expressão diferencial dos receptores de GA ajuda a moldar o padrão da atividade de sinalização de GA no SAM. Questionamos se o acúmulo diferencial de GA poderia estar envolvido. Para investigar essa possibilidade, utilizamos o sensor de GA FRET nlsGPS121. Um aumento na frequência de ativação foi detectado no SAM de nlsGPS1 tratado com 10 μM de GA4+7 por 100 min (Fig. Suplementar 9a-e), indicando que o nlsGPS1 responde a mudanças na concentração de GA no SAM, assim como nas raízes21. A distribuição espacial da frequência de ativação do nlsGPS1 revelou níveis relativamente baixos de GA nas camadas externas do SAM, mas mostrou que eles estavam elevados no centro e nas bordas do SAM (Fig. 4e e Fig. Suplementar 9a,c). Isso sugere que o GA também está distribuído no SAM com um padrão espacial comparável ao revelado pelo qmRGA. Como abordagem complementar, também tratamos o SAM com GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ou apenas Fl como controle negativo. O sinal de Fl foi distribuído por todo o SAM, incluindo a região central e o primórdio, embora em menor intensidade (Fig. 4j e Fig. Suplementar 10d). Em contraste, todos os três GA-Fl acumularam-se especificamente dentro das bordas do primórdio e em graus variados no restante do IPR, com GA7-Fl acumulando-se no maior domínio do IPR (Fig. 4k e Fig. Suplementar 10a,b). A quantificação da intensidade de fluorescência revelou que a razão entre a intensidade de IPR e a intensidade sem IPR foi maior no SAM tratado com GA-Fl em comparação ao SAM tratado com Fl (Fig. 4l e Fig. Suplementar 10c). Juntos, esses resultados sugerem que o GA está presente em concentrações mais altas nas células IPR localizadas mais próximas da borda do órgão. Isso sugere que o padrão de atividade de sinalização do GA no SAM resulta tanto da expressão diferencial dos receptores de GA quanto do acúmulo diferencial de GA nas células IPR próximas às bordas dos órgãos. Assim, nossa análise revelou um padrão espaço-temporal inesperado de sinalização do GA, com menor atividade no centro e primórdio do SAM e maior atividade no IPR na região periférica.
Para compreender o papel da atividade de sinalização diferencial de GA no SAM, analisamos a correlação entre a atividade de sinalização de GA, a expansão celular e a divisão celular usando imagens de lapso de tempo em tempo real do SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Dado o papel do GA na regulação do crescimento, esperava-se uma correlação positiva com os parâmetros de expansão celular. Portanto, primeiramente comparamos os mapas de atividade de sinalização de GA com mapas da taxa de crescimento da superfície celular (como um proxy para a força da expansão celular para uma determinada célula e para células-filhas em divisão) e com mapas de anisotropia de crescimento, que mede a direcionalidade da expansão celular (também usada aqui para uma determinada célula e para células-filhas em divisão; Fig. 5a, b, ver Métodos e Métodos Suplementares). Nossos mapas da taxa de crescimento da superfície celular do SAM são consistentes com observações anteriores38,39, com taxas de crescimento mínimas na borda e taxas de crescimento máximas em flores em desenvolvimento (Fig. 5a). A análise de componentes principais (ACP) mostrou que a atividade de sinalização de GA estava negativamente correlacionada com a intensidade do crescimento da superfície celular (Figura 5c). Também demonstramos que os principais eixos de variação, incluindo a entrada de sinalização de GA e a intensidade de crescimento, foram ortogonais à direção determinada pela alta expressão de CLV3, confirmando a exclusão de células do centro SAM nas análises restantes. A análise de correlação de Spearman confirmou os resultados de ACP (Figura 5d), indicando que sinais mais elevados de GA no IPR não resultaram em maior expansão celular. No entanto, a análise de correlação revelou uma ligeira correlação positiva entre a atividade de sinalização de GA e a anisotropia do crescimento (Figura 5c, d), sugerindo que a maior sinalização de GA no IPR influencia a direção do crescimento celular e, possivelmente, a posição do plano de divisão celular.
a, b Mapas de calor do crescimento médio da superfície (a) e anisotropia do crescimento (b) em SAM calculados em média sobre sete plantas independentes (usados como proxies para a força e direção da expansão celular, respectivamente). c A análise de PCA incluiu as seguintes variáveis: sinal de GA, intensidade de crescimento da superfície, anisotropia do crescimento da superfície e expressão de CLV3. O componente 1 de PCA foi principalmente correlacionado negativamente com a intensidade do crescimento da superfície e positivamente correlacionado com o sinal de GA. O componente 2 de PCA foi principalmente correlacionado positivamente com a anisotropia do crescimento da superfície e negativamente correlacionado com a expressão de CLV3. As porcentagens representam a variação explicada por cada componente. d Análise de correlação de Spearman entre o sinal de GA, a intensidade do crescimento da superfície e a anisotropia do crescimento da superfície na escala do tecido, excluindo CZ. O número à direita é o valor rho de Spearman entre duas variáveis. Asteriscos indicam casos em que a correlação/correlação negativa é altamente significativa. e Visualização 3D de células L1 de SAM Col-0 por microscopia confocal. Novas paredes celulares formadas no SAM (mas não no primórdio) em 10 h são coloridas de acordo com seus valores de ângulo. A barra de cores é mostrada no canto inferior direito. O encarte mostra a imagem 3D correspondente em 0 h. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. f Os gráficos de caixa exibem as taxas de divisão celular em IPR e não IPR Col-0 SAM (n = 10 plantas independentes). A linha central mostra a mediana e os limites da caixa indicam os 25º e 75º percentis. Os bigodes indicam os valores mínimo e máximo determinados com o software R. Os valores de p foram obtidos com o teste t bicaudal de Welch. g, h Diagrama esquemático mostrando (g) como medir o ângulo da nova parede celular (magenta) em relação à direção radial a partir do centro do SAM (linha pontilhada branca) (apenas valores de ângulo agudo, ou seja, 0–90°, são considerados) e (h) as direções circunferencial/lateral e radial dentro do meristema. i Histogramas de frequência da orientação do plano de divisão celular através do SAM (azul escuro), IPR (azul médio) e não IPR (azul claro), respectivamente. Os valores de p foram obtidos por um teste de Kolmogorov-Smirnov bicaudal. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. j Histogramas de frequência da orientação do plano de divisão celular do IPR ao redor de P3 (verde claro), P4 (verde médio) e P5 (verde escuro), respectivamente. Os valores de p foram obtidos por um teste de Kolmogorov-Smirnov bicaudal. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes.
Portanto, investigamos a seguir a correlação entre a sinalização de GA e a atividade de divisão celular, identificando paredes celulares recém-formadas durante o ensaio (Fig. 5e). Essa abordagem nos permitiu medir a frequência e a direção da divisão celular. Surpreendentemente, descobrimos que a frequência de divisões celulares no IPR e no restante do SAM (não IPR, Fig. 5f) foi semelhante, indicando que as diferenças na sinalização de GA entre células IPR e não IPR não afetam significativamente a divisão celular. Isso, somado à correlação positiva entre a sinalização de GA e a anisotropia de crescimento, nos levou a considerar se a atividade de sinalização de GA poderia influenciar a orientação do plano de divisão celular. Medimos a orientação da nova parede celular como um ângulo agudo em relação ao eixo radial que conecta o centro do meristema e o centro da nova parede celular (Fig. 5e-i) e observamos uma clara tendência das células se dividirem em ângulos próximos a 90° em relação ao eixo radial, com as maiores frequências observadas em 70-80° (23,28%) e 80-90° (22,62%) (Fig. 5e,i), correspondendo a divisões celulares na direção circunferencial/transversal (Fig. 5h). Para examinar a contribuição da sinalização GA para esse comportamento de divisão celular, analisamos os parâmetros de divisão celular no IPR e no não IPR separadamente (Fig. 5i). Observamos que a distribuição do ângulo de divisão em células IPR diferiu daquela em células não IPR ou em células em todo o SAM, com células IPR exibindo uma proporção maior de divisões celulares laterais/circulares, ou seja, 70-80° e 80-90° (33,86% e 30,71%, respectivamente, proporções correspondentes) (Fig. 5i). Assim, nossas observações revelaram uma associação entre alta sinalização de GA e uma orientação do plano de divisão celular próxima à direção circunferencial, semelhante à correlação entre a atividade de sinalização de GA e a anisotropia de crescimento (Fig. 5c, d). Para estabelecer ainda mais a conservação espacial dessa associação, medimos a orientação do plano de divisão em células IPR ao redor do primórdio a partir de P3, uma vez que a maior atividade de sinalização de GA foi detectada nessa região a partir de P4 (Fig. 4). Os ângulos de divisão do IPR ao redor de P3 e P4 não apresentaram diferenças estatisticamente significativas, embora uma frequência aumentada de divisões celulares laterais tenha sido observada no IPR ao redor de P4 (Fig. 5j). Entretanto, nas células IPR ao redor de P5, a diferença na orientação do plano de divisão celular tornou-se estatisticamente significativa, com um aumento acentuado na frequência de divisões celulares transversais (Fig. 5j). Em conjunto, esses resultados sugerem que a sinalização de GA pode controlar a orientação das divisões celulares no SAM, o que é consistente com relatos anteriores40,41 de que a alta sinalização de GA pode induzir a orientação lateral das divisões celulares no IPR.
Prevê-se que as células no IPR não sejam incorporadas aos primórdios, mas sim aos internódios2,42,43. A orientação transversal das divisões celulares no IPR pode resultar na organização típica de fileiras longitudinais paralelas de células epidérmicas nos internódios. Nossas observações descritas acima sugerem que a sinalização GA provavelmente desempenha um papel nesse processo, regulando a direção da divisão celular.
A perda da função de vários genes DELLA resulta em uma resposta GA constitutiva, e mutantes della podem ser usados para testar essa hipótese44. Primeiramente, analisamos os padrões de expressão de cinco genes DELLA no SAM. A fusão transcricional da linhagem GUS45 revelou que GAI, RGA, RGL1 e RGL2 (em uma extensão muito menor) foram expressos no SAM (Fig. Suplementar 11a-d). A hibridização in situ demonstrou ainda que o mRNA de GAI se acumula especificamente nos primórdios e nas flores em desenvolvimento (Fig. Suplementar 11e). Os mRNAs de RGL1 e RGL3 foram detectados em toda a copa do SAM e em flores mais velhas, enquanto o mRNA de RGL2 foi mais abundante na região da borda (Fig. Suplementar 11f-h). A imagem confocal do SAM pRGL3::RGL3-GFP confirmou a expressão observada pela hibridização in situ e mostrou que a proteína RGL3 se acumula na parte central do SAM (Fig. Suplementar 11i). Utilizando a linhagem pRGA::GFP-RGA, também constatamos que a proteína RGA se acumula no SAM, mas sua abundância diminui na borda a partir de P4 (Fig. 11j Suplementar). Notavelmente, os padrões de expressão de RGL3 e RGA são consistentes com maior atividade de sinalização de GA no IPR, conforme detectado por qmRGA (Fig. 4). Além disso, esses dados indicam que todos os DELLAs são expressos no SAM e que sua expressão coletiva abrange todo o SAM.
Em seguida, analisamos os parâmetros de divisão celular no SAM selvagem (Ler, controle) e nos mutantes gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Fig. 6a, b). Curiosamente, observamos uma mudança estatisticamente significativa na distribuição das frequências dos ângulos de divisão celular no mutante della global SAM em comparação com o tipo selvagem (Fig. 6c). Essa mudança no mutante della global deveu-se a um aumento na frequência de ângulos de 80–90° (34,71% vs. 24,55%) e, em menor extensão, de ângulos de 70–80° (23,78% vs. 20,18%), ou seja, correspondentes a divisões celulares transversais (Fig. 6c). A frequência de divisões não transversais (0–60°) também foi menor no mutante della global (Fig. 6c). A frequência de divisões celulares transversais aumentou significativamente no SAM do mutante della global (Fig. 6b). A frequência de divisões celulares transversais no IPR também foi maior no mutante della global em comparação com o tipo selvagem (Fig. 6d). Fora da região IPR, o tipo selvagem apresentou uma distribuição mais uniforme dos ângulos de divisão celular, enquanto o mutante della global preferiu divisões tangenciais como o IPR (Fig. 6e). Também quantificamos a orientação das divisões celulares no SAM de mutantes quintupletos da ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 e ga2ox6-2), um fundo mutante inativo para GA no qual o GA se acumula. Consistente com o aumento nos níveis de GA, o SAM da inflorescência do mutante ga2ox quíntuplo foi maior do que o de Col-0 (Fig. 12a, b suplementares) e, em comparação com Col-0, o SAM ga2ox quíntuplo apresentou uma distribuição distintamente diferente dos ângulos de divisão celular, com a frequência angular aumentando de 50° para 90°, ou seja, favorecendo novamente as divisões tangenciais (Fig. 12a-c suplementares). Assim, demonstramos que a ativação constitutiva da sinalização de GA e o acúmulo de GA induzem divisões celulares laterais no IPR e no restante do SAM.
a, b Visualização 3D da camada L1 de Ler corado com PI (a) e mutante global della (b) SAM usando microscopia confocal. Novas paredes celulares formadas no SAM (mas não no primórdio) ao longo de um período de 10 h são mostradas e coloridas de acordo com seus valores angulares. O encarte mostra o SAM em 0 h. A barra de cores é exibida no canto inferior direito. A seta em (b) aponta para um exemplo de arquivos de células alinhados no mutante global della. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. ce comparação da distribuição de frequência das orientações do plano de divisão celular em todo o SAM (d), IPR (e) e não IPR (f) entre Ler e global della. Os valores de p foram obtidos usando um teste de Kolmogorov-Smirnov bicaudal. f, g Visualização 3D de imagens confocais de SAM corado com PI de plantas transgênicas Col-0 (i) e pCUC2::gai-1-VENUS (j). Os painéis (a, b) mostram novas paredes celulares (mas não primórdios) formadas no SAM em 10 h. O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. h–j Comparação da distribuição de frequência das orientações do plano de divisão celular localizadas em todo o SAM (h), IPR (i) e não IPR (j) entre plantas Col-0 e pCUC2::gai-1-VENUS. Os valores de p foram obtidos usando um teste de Kolmogorov-Smirnov bicaudal.
Em seguida, testamos o efeito da inibição da sinalização de GA especificamente no IPR. Para tanto, utilizamos o promotor do copo cotilédone 2 (CUC2) para induzir a expressão de uma proteína gai-1 negativa dominante fundida a VENUS (na linhagem pCUC2::gai-1-VENUS). No SAM selvagem, o promotor CUC2 induz a expressão da maioria dos IPRs no SAM, incluindo células de borda, a partir do P4, e expressão específica semelhante foi observada em plantas pCUC2::gai-1-VENUS (veja abaixo). A distribuição dos ângulos de divisão celular no SAM ou IPR das plantas pCUC2::gai-1-VENUS não foi significativamente diferente daquela do tipo selvagem, embora, inesperadamente, tenhamos descoberto que as células sem IPR nessas plantas se dividiram em uma frequência maior, de 80 a 90° (Fig. 6f-j).
Sugeriu-se que a direção da divisão celular depende da geometria do SAM, em particular da tensão de tração gerada pela curvatura do tecido46. Portanto, questionamos se o formato do SAM foi alterado nas plantas mutantes della global e pCUC2::gai-1-VENUS. Conforme relatado anteriormente12, o tamanho do SAM do mutante della global foi maior do que o do tipo selvagem (Fig. Suplementar 13a, b, d). A hibridização in situ de CLV3 e RNA de STM confirmou a expansão do meristema nos mutantes della e demonstrou ainda a expansão lateral do nicho das células-tronco (Fig. Suplementar 13e, f, h, i). No entanto, a curvatura do SAM foi semelhante em ambos os genótipos (Fig. Suplementar 13k, m, n, p). Observamos um aumento semelhante no tamanho do mutante quádruplo Della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 sem alteração na curvatura em comparação com o tipo selvagem (Fig. Suplementar 13c, d, g, j, l, o, p). A frequência da orientação da divisão celular também foi afetada no mutante quádruplo Della, mas em menor extensão do que no mutante monolítico Della (Fig. Suplementar 12d-f). Esse efeito da dosagem, juntamente com a ausência de efeito na curvatura, sugere que a atividade residual de RGL3 no mutante quádruplo Della limita as alterações na orientação da divisão celular causadas pela perda da atividade de DELLA e que as alterações nas divisões celulares laterais ocorrem em resposta a alterações na atividade de sinalização de GA, e não a alterações na geometria de SAM. Conforme descrito acima, o promotor CUC2 controla a expressão de IPR no SAM a partir de P4 (Fig. 14a, b suplementares) e, em contraste, o SAM pCUC2::gai-1-VENUS apresentou tamanho reduzido, mas curvatura mais alta (Fig. 14c-h suplementares). Essa alteração na morfologia do SAM pCUC2::gai-1-VENUS pode resultar em uma distribuição diferente de tensões mecânicas em comparação ao tipo selvagem, no qual altas tensões circunferenciais começam a uma distância menor do centro do SAM47. Alternativamente, as alterações na morfologia do SAM pCUC2::gai-1-VENUS podem resultar de alterações nas propriedades mecânicas regionais induzidas pela expressão do transgene48. Em ambos os casos, isso poderia compensar parcialmente os efeitos das alterações na sinalização de GA, aumentando a probabilidade de as células se dividirem na orientação circunferencial/transversal, explicando nossas observações.
Em conjunto, nossos dados confirmam que a sinalização de GA mais alta desempenha um papel ativo na orientação lateral do plano de divisão celular no IPR. Eles também mostram que a curvatura do meristema também influencia a orientação do plano de divisão celular no IPR.
A orientação transversal do plano de divisão no IPR, devido à alta atividade de sinalização de GA, sugere que o GA pré-organiza um arquivo de células radiais na epiderme dentro do SAM para definir a organização celular que será posteriormente encontrada no internódio epidérmico. De fato, tais arquivos de células foram frequentemente visíveis em imagens de SAM de mutantes della global (Fig. 6b). Assim, para explorar mais a fundo a função de desenvolvimento do padrão espacial da sinalização de GA no SAM, utilizamos imagens de lapso de tempo para analisar a organização espacial das células no IPR em plantas selvagens (Ler e Col-0), mutantes della global e plantas transgênicas pCUC2::gai-1-VENUS.
Descobrimos que qmRGA mostrou que a atividade de sinalização de GA no IPR aumentou de P1/P2 e atingiu o pico em P4, e esse padrão permaneceu constante ao longo do tempo (Fig. 4a–f e Fig. Suplementar 8c–f, k). Para analisar a organização espacial das células no IPR com aumento do sinal de GA, rotulamos as células Ler IPR acima e aos lados de P4 de acordo com seu destino de desenvolvimento analisado 34 h após a primeira observação, ou seja, mais de dois tempos plastidiais, permitindo-nos acompanhar as células IPR durante o desenvolvimento do primórdio de P1/P2 a P4. Usamos três cores diferentes: amarelo para as células que foram integradas ao primórdio próximo a P4, verde para aquelas que estavam no IPR e roxo para aquelas que participaram de ambos os processos (Fig. 7a–c). Em t0 (0 h), 1–2 camadas de células IPR eram visíveis na frente de P4 (Fig. 7a). Como esperado, quando essas células se dividiram, o fizeram principalmente através do plano de divisão transversal (Figs. 7a-c). Resultados semelhantes foram obtidos usando o SAM Col-0 (com foco em P3, cuja borda se dobra de forma semelhante à de P4 em Ler), embora neste genótipo a dobra formada na borda floral tenha ocultado as células IPR mais rapidamente (Fig. 7g-i). Assim, o padrão de divisão das células IPR pré-organiza as células em fileiras radiais, como nos internódios. A organização das fileiras radiais e a localização das células IPR entre órgãos sucessivos sugerem que essas células são progenitoras internodais.
Aqui, desenvolvemos um biossensor de sinalização GA raciométrico, qmRGA, que permite o mapeamento quantitativo da atividade de sinalização GA resultante de concentrações combinadas de GA e receptor GA, minimizando a interferência com vias de sinalização endógenas, fornecendo assim informações sobre a função GA no nível celular. Para este fim, construímos uma proteína DELLA modificada, mRGA, que perdeu a capacidade de se ligar a parceiros de interação DELLA, mas permanece sensível à proteólise induzida por GA. qmRGA responde a mudanças exógenas e endógenas nos níveis de GA, e suas propriedades de detecção dinâmica permitem a avaliação de mudanças espaço-temporais na atividade de sinalização GA durante o desenvolvimento. qmRGA também é uma ferramenta muito flexível, pois pode ser adaptada a diferentes tecidos alterando o promotor usado para sua expressão (se necessário) e, dada a natureza conservada da via de sinalização GA e do motivo PFYRE entre angiospermas, é provável que seja transferível para outras espécies22. Consistente com isso, uma mutação equivalente na proteína DELLA do SLR1 do arroz (HYY497AAA) também demonstrou suprimir a atividade repressora do crescimento do SLR1, reduzindo apenas ligeiramente sua degradação mediada por GA, semelhante ao mRGA23. Notavelmente, estudos recentes em Arabidopsis mostraram que uma única mutação de aminoácido no domínio PFYRE (S474L) alterou a atividade transcricional do RGA sem afetar sua capacidade de interagir com parceiros de fatores de transcrição50. Embora essa mutação seja muito próxima das 3 substituições de aminoácidos presentes no mRGA, nossos estudos mostram que essas duas mutações alteram características distintas do DELLA. Embora a maioria dos parceiros de fatores de transcrição se ligue aos domínios LHR1 e SAW do DELLA26,51, alguns aminoácidos conservados no domínio PFYRE podem ajudar a estabilizar essas interações.
O desenvolvimento dos internódios é uma característica fundamental na arquitetura das plantas e na melhoria da produtividade. O qmRGA revelou maior atividade de sinalização de GA em células progenitoras de internódios do IPR. Combinando imagens quantitativas e genética, mostramos que os padrões de sinalização de GA sobrepõem planos de divisão celular circulares/transversais na epiderme do SAM, moldando a organização da divisão celular necessária para o desenvolvimento dos internódios. Vários reguladores da orientação do plano de divisão celular foram identificados durante o desenvolvimento52,53. Nosso trabalho fornece um exemplo claro de como a atividade de sinalização de GA regula esse parâmetro celular. DELLA pode interagir com complexos de proteínas de pré-dobramento41, portanto, a sinalização de GA pode regular a orientação do plano de divisão celular influenciando diretamente a orientação dos microtúbulos corticais40,41,54,55. Mostramos inesperadamente que, no SAM, o correlato da maior atividade de sinalização de GA não foi o alongamento ou a divisão celular, mas apenas a anisotropia do crescimento, o que é consistente com um efeito direto de GA na direção da divisão celular no IPR. No entanto, não podemos excluir que esse efeito também possa ser indireto, por exemplo, mediado pelo amolecimento da parede celular induzido por GA56. Alterações nas propriedades da parede celular induzem estresse mecânico57,58, que também pode influenciar a orientação do plano de divisão celular ao afetar a orientação dos microtúbulos corticais39,46,59. Os efeitos combinados do estresse mecânico induzido por GA e da regulação direta da orientação dos microtúbulos por GA podem estar envolvidos na geração de um padrão específico de orientação da divisão celular no IPR para definir os internódios, e mais estudos são necessários para testar essa ideia. Da mesma forma, estudos anteriores destacaram a importância das proteínas TCP14 e 15 que interagem com DELLA no controle da formação de internódios60,61 e esses fatores podem mediar a ação de GA juntamente com BREVIPEDICELLUS (BP) e PENNYWISE (PNY), que regulam o desenvolvimento dos internódios e demonstraram influenciar a sinalização de GA2,62. Dado que os DELLAs interagem com as vias de sinalização do brassinosteróide, etileno, ácido jasmônico e ácido abscísico (ABA)63,64 e que esses hormônios podem influenciar a orientação dos microtúbulos65, os efeitos do GA na orientação da divisão celular também podem ser mediados por outros hormônios.
Estudos citológicos iniciais mostraram que tanto a região interna quanto a externa do SAM de Arabidopsis são necessárias para o desenvolvimento dos internódios2,42. O fato de o GA regular ativamente a divisão celular nos tecidos internos12 corrobora uma função dupla do GA na regulação do tamanho do meristema e do internódio no SAM. O padrão de divisão celular direcional também é rigorosamente regulado no tecido do SAM interno, e essa regulação é essencial para o crescimento do caule52. Será interessante examinar se o GA também desempenha um papel na orientação do plano de divisão celular na organização do SAM interno, sincronizando assim a especificação e o desenvolvimento dos internódios dentro do SAM.
As plantas foram cultivadas in vitro em solo ou meio Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) suplementado com 1% de sacarose e 1% de ágar (Sigma) sob condições padrão (16 h de luz, 22 °C), exceto para experimentos de crescimento de hipocótilo e raiz nos quais as mudas foram cultivadas em placas verticais sob luz constante e 22 °C. Para experimentos de nitrato, as plantas foram cultivadas em meio MS modificado (meio vegetal bioWORLD) suplementado com nitrato adequado (0 ou 10 mM de KNO3), 0,5 mM de NH4-succinato, 1% de sacarose e 1% de ágar A (Sigma) sob condições de dia longo.
O cDNA de GID1a inserido em pDONR221 foi recombinado com pDONR P4-P1R-pUBQ10 e pDONR P2R-P3-mCherry em pB7m34GW para gerar pUBQ10::GID1a-mCherry. O DNA de IDD2 inserido em pDONR221 foi recombinado em pB7RWG266 para gerar p35S:IDD2-RFP. Para gerar pGID1b::2xmTQ2-GID1b, um fragmento de 3,9 kb a montante da região de codificação do GID1b e um fragmento de 4,7 kb contendo o cDNA do GID1b (1,3 kb) e o terminador (3,4 kb) foram primeiro amplificados usando os primers na Tabela Suplementar 3 e então inseridos em pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) e pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respectivamente, e finalmente recombinados com pDONR221 2xmTQ268 no vetor alvo pGreen 012567 usando clonagem Gateway. Para gerar pCUC2::LSSmOrange, a sequência promotora CUC2 (3229 pb a montante de ATG), seguida pela sequência codificadora de mOrange com deslocamento de Stokes grande (LSSmOrange)69 com o sinal de localização nuclear N7 e o terminador transcricional NOS, foram montadas no vetor de direcionamento de canamicina pGreen usando o sistema de recombinação Gateway de 3 fragmentos (Invitrogen). O vetor binário vegetal foi introduzido na cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens e introduzido em folhas de Nicotiana benthamiana pelo método de infiltração de Agrobacterium e em Arabidopsis thaliana Col-0 pelo método de imersão floral, respectivamente. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry e pCLV3::mCherry-NLS qmRGA foram isolados das progênies F3 e F1 dos respectivos cruzamentos, respectivamente.
A hibridização in situ de RNA foi realizada em ápices de brotos com aproximadamente 1 cm de comprimento72, que foram coletados e imediatamente fixados em solução de FAA (3,7% de formaldeído, 5% de ácido acético, 50% de etanol) pré-resfriada a 4 °C. Após 2 tratamentos a vácuo de 15 minutos, o fixador foi trocado e as amostras foram incubadas durante a noite. Os cDNAs de GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 e RGL3 e as sondas antisense para suas 3'-UTRs foram sintetizados utilizando os primers mostrados na Tabela Suplementar 3, conforme descrito por Rosier et al.73. Sondas marcadas com digoxigenina foram imunodetectadas usando anticorpos de digoxigenina (diluição de 3000 vezes; Roche, número de catálogo: 11 093 274 910), e as seções foram coradas com solução de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP, diluição de 250 vezes)/nitroazul de tetrazólio (NBT, diluição de 200 vezes).
Horário da publicação: 10 de fevereiro de 2025