Neste estudo, os efeitos estimulatórios do tratamento combinado dereguladores de crescimento vegetalInvestigou-se o efeito do 2,4-D e da cinetina, bem como de nanopartículas de óxido de ferro (Fe₃O₄-NPs), na morfogênese in vitro e na produção de metabólitos secundários em *Hypericum perforatum* L. O tratamento otimizado [2,4-D (0,5 mg/L) + cinetina (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] melhorou significativamente os parâmetros de crescimento da planta: a altura da planta aumentou 59,6%, o comprimento da raiz 114,0%, o número de gemas 180,0% e a massa fresca do calo 198,3% em comparação com o grupo controle. Esse tratamento combinado também aumentou a eficiência de regeneração (50,85%) e o teor de hipericina em 66,6%. A análise por GC-MS revelou altos teores de hiperosídeo, β-patoleno e álcool cetílico, representando 93,36% da área total do pico, enquanto os teores de fenólicos totais e flavonoides aumentaram em até 80,1%. Esses resultados indicam que os reguladores de crescimento vegetal (RCVs) e as nanopartículas de Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) exercem um efeito sinérgico, estimulando a organogênese e o acúmulo de compostos bioativos, o que representa uma estratégia promissora para o melhoramento biotecnológico de plantas medicinais.
A erva-de-são-joão (Hypericum perforatum L.), também conhecida como erva-de-são-joão, é uma planta herbácea perene da família Hypericaceae que possui valor econômico.[1] Seus componentes bioativos potenciais incluem taninos naturais, xantonas, floroglucinol, naftalenodiantrona (hiperina e pseudohiperina), flavonoides, ácidos fenólicos e óleos essenciais.[2,3,4] A erva-de-são-joão pode ser propagada por métodos tradicionais; no entanto, a sazonalidade dos métodos tradicionais, a baixa germinação das sementes e a suscetibilidade a doenças limitam seu potencial para cultivo em larga escala e formação contínua de metabólitos secundários.[1,5,6]
Assim, a cultura de tecidos in vitro é considerada um método eficaz para a rápida propagação de plantas, conservação de recursos de germoplasma e aumento do rendimento de compostos medicinais [7, 8]. Os reguladores de crescimento vegetal (RCVs) desempenham um papel crucial na regulação da morfogênese e são necessários para o cultivo in vitro de calos e organismos inteiros. A otimização de suas concentrações e combinações é crucial para o sucesso desses processos de desenvolvimento [9]. Portanto, compreender a composição e a concentração adequadas de reguladores é importante para melhorar o crescimento e a capacidade regenerativa da erva-de-são-joão (H. perforatum) [10].
As nanopartículas de óxido de ferro (Fe₃O₄) são uma classe de nanopartículas que foram ou estão sendo desenvolvidas para cultura de tecidos. O Fe₃O₄ possui propriedades magnéticas significativas, boa biocompatibilidade e a capacidade de promover o crescimento de plantas e reduzir o estresse ambiental, por isso tem atraído considerável atenção em projetos de cultura de tecidos. As aplicações potenciais dessas nanopartículas podem incluir a otimização da cultura in vitro para promover a divisão celular, melhorar a absorção de nutrientes e ativar enzimas antioxidantes [11].
Embora as nanopartículas tenham demonstrado bons efeitos promotores no crescimento vegetal, estudos sobre a aplicação combinada de nanopartículas de Fe₃O₄ e reguladores de crescimento vegetal otimizados em *H. perforatum* ainda são escassos. Para preencher essa lacuna de conhecimento, este estudo avaliou os efeitos da combinação desses fatores na morfogênese in vitro e na produção de metabólitos secundários, visando fornecer novas perspectivas para o aprimoramento das características de plantas medicinais. Portanto, este estudo tem dois objetivos: (1) otimizar a concentração de reguladores de crescimento vegetal para promover efetivamente a formação de calos, a regeneração de brotos e o enraizamento in vitro; e (2) avaliar os efeitos das nanopartículas de Fe₃O₄ nos parâmetros de crescimento in vitro. Planos futuros incluem a avaliação da taxa de sobrevivência das plantas regeneradas durante a aclimatização (in vitro). Espera-se que os resultados deste estudo melhorem significativamente a eficiência da micropropagação de *H. perforatum*, contribuindo assim para o uso sustentável e as aplicações biotecnológicas dessa importante planta medicinal.
Neste estudo, obtivemos explantes foliares de plantas anuais de erva-de-são-joão (plantas-mãe) cultivadas em campo. Esses explantes foram utilizados para otimizar as condições de cultivo in vitro. Antes do cultivo, as folhas foram lavadas abundantemente em água destilada corrente por vários minutos. Em seguida, as superfícies dos explantes foram desinfetadas por imersão em etanol a 70% por 30 segundos, seguida de imersão em uma solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) a 1,5% contendo algumas gotas de Tween 20 por 10 minutos. Finalmente, os explantes foram lavados três vezes com água destilada estéril antes de serem transferidos para o próximo meio de cultura.
Ao longo das quatro semanas seguintes, os parâmetros de regeneração dos brotos foram medidos, incluindo a taxa de regeneração, o número de brotos por explante e o comprimento dos brotos. Quando os brotos regenerados atingiram um comprimento de pelo menos 2 cm, foram transferidos para um meio de enraizamento composto por meio MS com metade da concentração original, 0,5 mg/L de ácido indolbutírico (AIB) e 0,3% de goma guar. O cultivo de raízes continuou por três semanas, período durante o qual a taxa de enraizamento, o número de raízes e o comprimento das raízes foram medidos. Cada tratamento foi repetido três vezes, com 10 explantes cultivados por repetição, resultando em aproximadamente 30 explantes por tratamento.
A altura das plantas foi medida em centímetros (cm) com uma régua, da base da planta até a ponta da folha mais alta. O comprimento da raiz foi medido em milímetros (mm) imediatamente após a remoção cuidadosa das mudas e do substrato de cultivo. O número de gemas por explante foi contado diretamente em cada planta. O número de manchas pretas nas folhas, conhecidas como nódulos, foi medido visualmente. Acredita-se que esses nódulos pretos sejam glândulas contendo hipericina, ou manchas oxidativas, e são usados como um indicador fisiológico da resposta da planta ao tratamento. Após a remoção de todo o substrato de cultivo, o peso fresco das mudas foi medido usando uma balança eletrônica com precisão de miligramas (mg).
O método para calcular a taxa de formação de calos é o seguinte: após o cultivo de explantes em um meio contendo diversos reguladores de crescimento (cinases, 2,4-D e Fe3O4) por quatro semanas, conta-se o número de explantes capazes de formar calos. A fórmula para calcular a taxa de formação de calos é a seguinte:
Cada tratamento foi repetido três vezes, com pelo menos 10 explantes examinados em cada repetição.
A taxa de regeneração reflete a proporção de tecido caloso que completa com sucesso o processo de diferenciação do broto após a fase de formação do calo. Esse indicador demonstra a capacidade do tecido caloso de se transformar em tecido diferenciado e crescer, dando origem a novos órgãos da planta.
O coeficiente de enraizamento é a razão entre o número de ramos capazes de enraizar e o número total de ramos. Esse indicador reflete o sucesso da fase de enraizamento, que é crucial na micropropagação e na propagação de plantas, pois um bom enraizamento ajuda as mudas a sobreviverem melhor em condições de cultivo.
Os compostos de hipericina foram extraídos com metanol a 90%. Cinquenta mg de material vegetal seco foram adicionados a 1 ml de metanol e sonicados por 20 min a 30 kHz em um limpador ultrassônico (modelo A5120-3YJ) à temperatura ambiente no escuro. Após a sonicação, a amostra foi centrifugada a 6000 rpm por 15 min. O sobrenadante foi coletado e a absorbância da hipericina foi medida a 592 nm usando um espectrofotômetro Plus-3000 S de acordo com o método descrito por Conceição et al. [14].
A maioria dos tratamentos com reguladores de crescimento vegetal (RCVs) e nanopartículas de óxido de ferro (Fe₃O₄-NPs) não induziu a formação de nódulos negros nas folhas regeneradas. Não foram observados nódulos em nenhum dos tratamentos com 0,5 ou 1 mg/L de 2,4-D, 0,5 ou 1 mg/L de cinetina, ou 1, 2 ou 4 mg/L de nanopartículas de óxido de ferro. Algumas combinações mostraram um ligeiro aumento no desenvolvimento de nódulos (mas não estatisticamente significativo) em concentrações mais elevadas de cinetina e/ou nanopartículas de óxido de ferro, como a combinação de 2,4-D (0,5–2 mg/L) com cinetina (1–1,5 mg/L) e nanopartículas de óxido de ferro (2–4 mg/L). Esses resultados são mostrados na Figura 2. Os nódulos negros representam glândulas ricas em hipericina, tanto naturais quanto benéficas. Neste estudo, os nódulos negros foram principalmente associados ao escurecimento dos tecidos, indicando um ambiente favorável ao acúmulo de hipericina. O tratamento com 2,4-D, cinetina e nanopartículas de Fe₃O₄ promoveu o crescimento do calo, reduziu o escurecimento e aumentou o teor de clorofila, sugerindo melhora da função metabólica e potencial redução do dano oxidativo [37]. Este estudo avaliou os efeitos da cinetina em combinação com 2,4-D e nanopartículas de Fe₃O₄ no crescimento e desenvolvimento do calo de erva-de-são-joão (Fig. 3a–g). Estudos anteriores mostraram que as nanopartículas de Fe₃O₄ possuem atividades antifúngicas e antimicrobianas [38, 39] e, quando usadas em combinação com reguladores de crescimento vegetal, podem estimular os mecanismos de defesa da planta e reduzir os índices de estresse celular [18]. Embora a biossíntese de metabólitos secundários seja geneticamente regulada, seu rendimento real depende muito das condições ambientais. Alterações metabólicas e morfológicas podem influenciar os níveis de metabólitos secundários, regulando a expressão de genes específicos das plantas e respondendo a fatores ambientais. Além disso, indutores podem desencadear a ativação de novos genes, que, por sua vez, estimulam a atividade enzimática, ativando, em última instância, múltiplas vias biossintéticas e levando à formação de metabólitos secundários. Ademais, outro estudo mostrou que a redução do sombreamento aumenta a exposição à luz solar, elevando, assim, as temperaturas diurnas no habitat natural de *Hypericum perforatum*, o que também contribui para o aumento da produção de hipericina. Com base nesses dados, este estudo investigou o papel de nanopartículas de ferro como potenciais indutores em cultura de tecidos. Os resultados mostraram que essas nanopartículas podem ativar genes envolvidos na biossíntese de hesperidina por meio de estimulação enzimática, levando ao aumento do acúmulo desse composto (Fig. 2). Portanto, em comparação com plantas que crescem em condições naturais, pode-se argumentar que a produção desses compostos in vivo também pode ser aumentada quando um estresse moderado é combinado com a ativação de genes envolvidos na biossíntese de metabólitos secundários. Os tratamentos combinados geralmente têm um efeito positivo na taxa de regeneração, mas, em alguns casos, esse efeito é atenuado. Notavelmente, o tratamento com 1 mg/L de 2,4-D, 1,5 mg/L de quinase e diferentes concentrações pôde aumentar de forma independente e significativa a taxa de regeneração em 50,85% em comparação com o grupo controle (Fig. 4c). Esses resultados sugerem que combinações específicas de nanohormônios podem agir sinergicamente para promover o crescimento vegetal e a produção de metabólitos, o que é de grande importância para o cultivo de tecidos de plantas medicinais. Palmer e Keller [50] mostraram que o tratamento com 2,4-D pode induzir a formação de calos em St. perforatum, enquanto a adição de quinase aumentou significativamente a formação de calos e a regeneração. Esse efeito foi devido à melhoria do equilíbrio hormonal e à estimulação da divisão celular. Bal et al. [51] descobriram que o tratamento com nanopartículas de Fe₃O₄ pode aumentar a função de enzimas antioxidantes, promovendo assim o crescimento radicular em St. perforatum. Meios de cultura contendo nanopartículas de Fe₃O₄ em concentrações de 0,5 mg/L, 1 mg/L e 1,5 mg/L melhoraram a taxa de regeneração de plantas de linho [52]. O uso de cinetina, 2,4-diclorobenzotiazolinona e nanopartículas de Fe₃O₄ melhorou significativamente as taxas de formação de calos e raízes; no entanto, os potenciais efeitos colaterais do uso desses hormônios para regeneração in vitro precisam ser considerados. Por exemplo, o uso prolongado ou em altas concentrações de 2,4-diclorobenzotiazolinona ou cinetina pode resultar em variação clonal somática, estresse oxidativo, morfologia anormal do calo ou vitrificação. Portanto, uma alta taxa de regeneração não prediz necessariamente estabilidade genética. Todas as plantas regeneradas devem ser avaliadas usando marcadores moleculares (por exemplo, RAPD, ISSR, AFLP) ou análise citogenética para determinar sua homogeneidade e similaridade com plantas in vivo [53,54,55].
Este estudo demonstrou, pela primeira vez, que o uso combinado de reguladores de crescimento vegetal (2,4-D e cinetina) com nanopartículas de Fe₃O₄ pode aumentar a morfogênese e o acúmulo de metabólitos bioativos importantes (incluindo hipericina e hiperosídeo) em *Hypericum perforatum*. O regime de tratamento otimizado (1 mg/L de 2,4-D + 1 mg/L de cinetina + 4 mg/L de nanopartículas de Fe₃O₄) não apenas maximizou a formação de calos, a organogênese e o rendimento de metabólitos secundários, como também demonstrou um leve efeito indutor, potencialmente melhorando a tolerância ao estresse e o valor medicinal da planta. A combinação de nanotecnologia e cultura de tecidos vegetais fornece uma plataforma sustentável e eficiente para a produção in vitro em larga escala de compostos medicinais. Esses resultados abrem caminho para aplicações industriais e futuras pesquisas sobre mecanismos moleculares, otimização de dosagem e precisão genética, conectando, assim, a pesquisa fundamental em plantas medicinais com a biotecnologia prática.
Data de publicação: 12/12/2025