O medicamento anti-helmíntico N,N-dietil-m-toluamida (DEET) foi relatado como inibidor da AChE (acetilcolinesterase) e possui propriedades potencialmente carcinogênicas devido à vascularização excessiva. Neste artigo, mostramos que o DEET estimula especificamente as células endoteliais que promovem a angiogênese, aumentando assim o crescimento tumoral. O DEET ativa processos celulares que levam à angiogênese, incluindo proliferação, migração e adesão. Isso está associado ao aumento da produção de NO e da expressão de VEGF em células endoteliais. O silenciamento de M3 ou o uso de inibidores farmacológicos de M3 aboliu todos esses efeitos, sugerindo que a angiogênese induzida por DEET é sensível a M3. Experimentos envolvendo sinalização de cálcio em células endoteliais e HEK com superexpressão de receptores M3, bem como estudos de ligação e docking, indicam que o DEET atua como um modulador alostérico dos receptores M3. Além disso, o DEET inibe a AChE, aumentando assim a biodisponibilidade da acetilcolina e sua ligação aos receptores M3, e potencializando os efeitos pró-angiogênicos por meio da regulação alostérica.
As células endoteliais primárias foram isoladas da aorta de camundongos Swiss. O método de extração foi adaptado do protocolo de Kobayashi 26 . As células endoteliais murinas foram cultivadas em meio EBM-2 suplementado com 5% de SFB inativado por calor até a quarta passagem.
O efeito de duas concentrações de DEET na proliferação de HUVEC, U87MG ou BF16F10 foi analisado utilizando o Kit de Ensaio de Proliferação Celular CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Resumidamente, 5,103 células por poço foram semeadas em uma placa de 96 poços, deixadas aderindo durante a noite e, em seguida, tratadas com DEET por 24 h. Após a remoção do meio de crescimento, adicionou-se solução de ligação de corante a cada poço da microplaca e incubou-se as células a 37 °C por 30 min. Os níveis de fluorescência foram determinados utilizando um leitor de microplacas multimodo Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanha) equipado com filtros de excitação de 485 nm e filtros de emissão de 530 nm.
As células HUVEC foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 104 células por poço. As células foram tratadas com DEET por 24 h. A viabilidade celular foi avaliada por meio de um ensaio colorimétrico de MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Os valores de densidade óptica foram obtidos em um leitor de microplacas multimodo (Mithras LB940) a um comprimento de onda de 570 nm.
Os efeitos do DEET foram estudados por meio de ensaios de angiogênese in vitro. O tratamento com 10-8 M ou 10-5 M de DEET aumentou a formação do comprimento capilar em HUVECs (Fig. 1a, b, barras brancas). Comparado ao grupo controle, o tratamento com concentrações de DEET variando de 10-14 a 10-5 M mostrou que o comprimento capilar atingiu um platô em 10-8 M de DEET (Fig. S2 Suplementar). Não foi encontrada diferença significativa no efeito proangiogênico in vitro de HUVECs tratadas com DEET na faixa de concentração de 10-8 M e 10-5 M.
Para determinar o efeito do DEET na neovascularização, realizamos estudos de neovascularização in vivo. Após 14 dias, camundongos injetados com células endoteliais pré-cultivadas com 10-8 M ou 10-5 M de DEET apresentaram um aumento significativo no conteúdo de hemoglobina (Fig. 1c, barras brancas).
Além disso, a neovascularização induzida por DEET foi estudada em camundongos portadores de xenoenxerto U87MG que receberam injeções diárias (ip) de DEET em uma dose conhecida por induzir concentrações plasmáticas de 10-5 M, o que é normal em humanos expostos. Tumores detectáveis (isto é, tumores >100 mm³) foram observados 14 dias após a injeção de células U87MG em camundongos. No dia 28, o crescimento tumoral foi significativamente aumentado em camundongos tratados com DEET em comparação com camundongos controle (Fig. 1d, quadrados). Além disso, a coloração de tumores com CD31 mostrou que o DEET aumentou significativamente a área capilar, mas não a densidade microvascular. (Fig. 1e-g).
Para determinar o papel dos receptores muscarínicos na proliferação induzida por DETA, utilizou-se 10-8 M ou 10-5 M de DETA na presença de pFHHSiD (10-7 M, um antagonista seletivo do receptor M3). Tratamento de HUVEC. O pFHHSiD bloqueou completamente as propriedades proliferativas do DETA em todas as concentrações (Tabela 1).
Nessas condições, também examinamos se o DEET aumentaria o comprimento capilar em células HUVEC. Da mesma forma, o pFHHSiD preveniu significativamente o comprimento capilar induzido por DEET (Fig. 1a, b, barras cinzas). Além disso, experimentos semelhantes foram realizados com siRNA M3. Embora o siRNA de controle não tenha sido eficaz na promoção da formação capilar, o silenciamento do receptor muscarínico M3 anulou a capacidade do DEET de aumentar o comprimento capilar (Fig. 1a, b, barras pretas).
Além disso, tanto a vascularização induzida por DEET in vitro quanto a neovascularização in vivo foram completamente bloqueadas por pFHHSiD (Fig. 1c, d, círculos). Esses resultados indicam que o DEET promove a angiogênese por meio de uma via sensível a antagonistas seletivos do receptor M3 ou siRNA M3.
A AChE é o alvo molecular do DEET. Medicamentos como o donepezila, que atuam como inibidores da AChE, podem estimular a angiogênese da EC in vitro e em modelos de isquemia de membros posteriores em camundongos14. Testamos o efeito de duas concentrações de DEET na atividade da enzima AChE em HUVEC. Concentrações baixas (10-8 M) e altas (10-5 M) de DEET diminuíram a atividade da AChE endotelial em comparação com as condições de controle (Fig. 2).
Ambas as concentrações de DEET (10-8 M e 10-5 M) reduziram a atividade da acetilcolinesterase em células HUVEC. BW284c51 (10-5 M) foi usado como controle para inibidores de acetilcolinesterase. Os resultados são expressos como porcentagem da atividade da AChE em células HUVEC tratadas com as duas concentrações de DEET em comparação com células tratadas com veículo. Os valores são expressos como média ± erro padrão da média (EPM) de seis experimentos independentes. *p < 0,05 em comparação com o controle (teste de comparação múltipla de Kruskal-Wallis e Dunn).
O óxido nítrico (NO) está envolvido no processo angiogênico 33, portanto, a produção de NO em células HUVEC estimuladas por DEET foi estudada. A produção endotelial de NO tratada com DEET aumentou em comparação com as células controle, mas atingiu significância apenas na dose de 10-8 M (Fig. 3c). Para determinar as alterações moleculares que controlam a produção de NO induzida por DEET, a expressão e a ativação da eNOS foram analisadas por Western blotting. Embora o tratamento com DEET não tenha alterado a expressão da eNOS, ele aumentou significativamente a fosforilação da eNOS em seu sítio de ativação (Ser-1177), enquanto diminuiu seu sítio inibitório (Thr-495) em comparação com células não tratadas na fosforilação da eNOS (Fig. 3d). Além disso, a proporção de eNOS fosforilada no sítio de ativação e no sítio inibitório foi calculada após a normalização da quantidade de eNOS fosforilada em relação à quantidade total de enzima. Essa proporção aumentou significativamente em células HUVEC tratadas com cada concentração de DEET em comparação com células não tratadas (Fig. 3d).
Por fim, a expressão de VEGF, um dos principais fatores proangiogênicos, foi analisada por Western blotting. O DEET aumentou significativamente a expressão de VEGF, enquanto o pFHHSiD bloqueou completamente essa expressão.
Como os efeitos do DEET são sensíveis tanto ao bloqueio farmacológico quanto à regulação negativa dos receptores M3, testamos a hipótese de que o DEET poderia aumentar a sinalização de cálcio. Surpreendentemente, o DEET não conseguiu aumentar o cálcio citoplasmático em HUVEC (dados não mostrados) e HEK/M3 (Fig. 4a, b) para ambas as concentrações utilizadas.
Horário de publicação: 30 de dezembro de 2024