O medicamento anti-helmíntico N,N-dietil-m-toluamida (DEETO DEET (etileno glicol) tem sido relatado como inibidor da AChE (acetilcolinesterase) e apresenta potencial carcinogênico devido à vascularização excessiva. Neste artigo, demonstramos que o DEET estimula especificamente células endoteliais que promovem a angiogênese, aumentando, assim, o crescimento tumoral. O DEET ativa processos celulares que levam à angiogênese, incluindo proliferação, migração e adesão. Isso está associado ao aumento da produção de NO (óxido nítrico) e da expressão de VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) em células endoteliais. O silenciamento do receptor M3 ou o uso de inibidores farmacológicos do M3 aboliram todos esses efeitos, sugerindo que a angiogênese induzida por DEET é sensível ao M3. Experimentos envolvendo a sinalização de cálcio em células endoteliais e células HEK superexpressando receptores M3, bem como estudos de ligação e acoplamento molecular, indicam que o DEET atua como um modulador alostérico dos receptores M3. Além disso, o DEET inibe a AChE, aumentando, assim, a biodisponibilidade da acetilcolina e sua ligação aos receptores M3, e potencializando os efeitos pró-angiogênicos por meio da regulação alostérica.
Células endoteliais primárias foram isoladas da aorta de camundongos suíços. O método de extração foi adaptado do protocolo de Kobayashi 26. As células endoteliais murinas foram cultivadas em meio EBM-2 suplementado com 5% de FBS inativado pelo calor até a quarta passagem.
O efeito de duas concentrações de DEET na proliferação de células HUVEC, U87MG ou BF16F10 foi analisado utilizando o kit de ensaio de proliferação celular CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Resumidamente, 5 x 10³ células por poço foram semeadas em uma placa de 96 poços, deixadas em incubação durante a noite para adesão e, em seguida, tratadas com DEET por 24 horas. Após a remoção do meio de cultura, adicionou-se a solução de ligação do corante a cada poço da microplaca e as células foram incubadas a 37 °C por 30 minutos. Os níveis de fluorescência foram determinados utilizando um leitor de microplacas multimodo Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanha) equipado com filtros de excitação de 485 nm e filtros de emissão de 530 nm.
Células HUVEC foram semeadas em placas de 96 poços na densidade de 10⁴ células por poço. As células foram tratadas com DEET por 24 horas. A viabilidade celular foi avaliada utilizando um ensaio colorimétrico MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Os valores de densidade óptica foram obtidos em um leitor de microplacas multimodo (Mithras LB940) em um comprimento de onda de 570 nm.
Os efeitos do DEET foram estudados utilizando ensaios de angiogênese in vitro. O tratamento com DEET nas concentrações de 10⁻⁸ M ou 10⁻⁵ M aumentou a formação de capilares em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) (Fig. 1a, b, barras brancas). Comparado ao grupo controle, o tratamento com concentrações de DEET variando de 10⁻¹⁴ a 10⁻⁵ M mostrou que o comprimento dos capilares atingiu um platô na concentração de 10⁻⁸ M (Fig. S2 suplementar). Não foi encontrada diferença significativa no efeito pró-angiogênico in vitro das HUVECs tratadas com DEET nas concentrações de 10⁻⁸ M e 10⁻⁵ M.
Para determinar o efeito do DEET na neovascularização, realizamos estudos de neovascularização in vivo. Após 14 dias, camundongos injetados com células endoteliais pré-cultivadas com 10-8 M ou 10-5 M de DEET apresentaram um aumento significativo no conteúdo de hemoglobina (Fig. 1c, barras brancas).
Além disso, a neovascularização induzida por DEET foi estudada em camundongos portadores de xenoenxertos de U87MG que receberam injeções diárias (ip) de DEET em uma dose conhecida por induzir concentrações plasmáticas de 10⁻⁵ M, que é normal em humanos expostos. Tumores detectáveis (ou seja, tumores >100 mm³) foram observados 14 dias após a injeção de células U87MG nos camundongos. No 28º dia, o crescimento tumoral foi significativamente maior nos camundongos tratados com DEET em comparação com os camundongos do grupo controle (Fig. 1d, quadrados). Além disso, a coloração de CD31 nos tumores mostrou que o DEET aumentou significativamente a área capilar, mas não a densidade microvascular (Fig. 1e–g).
Para determinar o papel dos receptores muscarínicos na proliferação induzida por DETA, utilizou-se DETA em concentrações de 10⁻⁸ M ou 10⁻⁵ M na presença de pFHHSiD (10⁻⁷ M, um antagonista seletivo do receptor M3). O tratamento de células HUVEC com pFHHSiD bloqueou completamente as propriedades proliferativas do DETA em todas as concentrações (Tabela 1).
Nessas condições, também examinamos se o DEET aumentaria o comprimento dos capilares em células HUVEC. De forma semelhante, o pFHHSiD preveniu significativamente o aumento do comprimento dos capilares induzido pelo DEET (Fig. 1a, b, barras cinzas). Além disso, experimentos similares foram realizados com siRNA M3. Embora o siRNA controle não tenha sido eficaz na promoção da formação de capilares, o silenciamento do receptor muscarínico M3 aboliu a capacidade do DEET de aumentar o comprimento dos capilares (Fig. 1a, b, barras pretas).
Além disso, tanto a vascularização induzida por DEET em concentrações de 10⁻⁸ M ou 10⁻⁵ M in vitro quanto a neovascularização in vivo foram completamente bloqueadas por pFHHSiD (Fig. 1c, d, círculos). Esses resultados indicam que o DEET promove a angiogênese por meio de uma via sensível a antagonistas seletivos do receptor M3 ou siRNA para M3.
A AChE é o alvo molecular do DEET. Fármacos como o donepezil, que atuam como inibidores da AChE, podem estimular a angiogênese endotelial in vitro e em modelos de isquemia de membros posteriores em camundongos14. Testamos o efeito de duas concentrações de DEET na atividade da enzima AChE em HUVEC. Concentrações baixas (10-8 M) e altas (10-5 M) de DEET diminuíram a atividade da AChE endotelial em comparação com as condições de controle (Fig. 2).
Ambas as concentrações de DEET (10⁻⁸ M e 10⁻⁵ M) reduziram a atividade da acetilcolinesterase em células HUVEC. O composto BW284c51 (10⁻⁵ M) foi utilizado como controle para os inibidores da acetilcolinesterase. Os resultados são expressos como porcentagem da atividade da AChE em células HUVEC tratadas com as duas concentrações de DEET em comparação com as células tratadas com o veículo. Os valores são expressos como média ± erro padrão da média (EPM) de seis experimentos independentes. *p < 0,05 em comparação com o controle (teste de comparações múltiplas de Kruskal-Wallis e Dunn).
O óxido nítrico (NO) está envolvido no processo angiogênico33; portanto, a produção de NO em HUVECs estimuladas por DEET foi estudada. A produção de NO endotelial tratada com DEET aumentou em comparação com as células controle, mas atingiu significância estatística apenas na dose de 10-8 M (Fig. 3c). Para determinar as alterações moleculares que controlam a produção de NO induzida por DEET, a expressão e a ativação da eNOS foram analisadas por Western blotting. Embora o tratamento com DEET não tenha alterado a expressão da eNOS, aumentou significativamente a fosforilação da eNOS em seu sítio de ativação (Ser-1177), enquanto diminuiu a fosforilação em seu sítio inibitório (Thr-495) em comparação com as células não tratadas (Fig. 3d). Além disso, a razão entre a eNOS fosforilada no sítio de ativação e no sítio inibitório foi calculada após a normalização da quantidade de eNOS fosforilada em relação à quantidade total da enzima. Essa razão aumentou significativamente nas HUVECs tratadas com cada concentração de DEET em comparação com as células não tratadas (Fig. 3d).
Por fim, a expressão de VEGF, um dos principais fatores pró-angiogênicos, foi analisada por Western blotting. O DEET aumentou significativamente a expressão de VEGF, enquanto o pFHHSiD bloqueou completamente essa expressão.
Como os efeitos do DEET são sensíveis tanto ao bloqueio farmacológico quanto à regulação negativa dos receptores M3, testamos a hipótese de que o DEET poderia aumentar a sinalização de cálcio. Surpreendentemente, o DEET não conseguiu aumentar o cálcio citoplasmático em HUVEC (dados não mostrados) e HEK/M3 (Fig. 4a, b) para ambas as concentrações utilizadas.
Data de publicação: 30 de dezembro de 2024