Em um projeto anterior que testava a eficácia de fábricas de processamento de alimentos locais contra mosquitos na Tailândia, descobriu-se que os óleos essenciais (OE) de Cyperus rotundus, galanga e canela possuíam boa atividade antimosquito contra o Aedes aegypti. Na tentativa de reduzir o uso de métodos tradicionais, [aqui faltam informações sobre métodos tradicionais].inseticidasPara melhorar o controle de populações de mosquitos resistentes, este estudo teve como objetivo identificar o potencial sinergismo entre os efeitos adulticidas do óxido de etileno e a toxicidade da permetrina para mosquitos Aedes aegypti, incluindo cepas resistentes e sensíveis a piretroides.
Avaliar a composição química e a atividade bactericida do óleo essencial extraído dos rizomas de C. rotundus e A. galanga e da casca de C. verum contra a cepa suscetível Muang Chiang Mai (MCM-S) e a cepa resistente Pang Mai Dang (PMD-R). Um bioensaio com a mistura de óleo essencial e permetrina em adultos de Aedes aegypti também foi realizado para compreender sua atividade sinérgica.
A caracterização química utilizando o método analítico GC-MS mostrou que 48 compostos foram identificados nos óleos essenciais de C. rotundus, A. galanga e C. verum, representando 80,22%, 86,75% e 97,24% do total de componentes, respectivamente. Cipereno (14,04%), β-bisaboleno (18,27%) e cinamaldeído (64,66%) são os principais componentes do óleo de Cyperus rotundus, do óleo de galanga e do óleo balsâmico, respectivamente. Em ensaios biológicos de mortalidade de adultos, as vesículas extracelulares (VEs) de C. rotundus, A. galanga e C. verum foram eficazes na eliminação de Ae. Os valores de DL50 para Aedes aegypti, MCM-S e PMD-R foram de 10,05 e 9,57 μg/mg fêmea, 7,97 e 7,94 μg/mg fêmea e 3,30 e 3,22 μg/mg fêmea, respectivamente. A eficácia de MCM-S e PMD-R na eliminação de Aedes aegypti adultos nesses óleos essenciais foi próxima à do butóxido de piperonila (valores de PBO, DL50 = 6,30 e 4,79 μg/mg fêmea, respectivamente), mas não tão pronunciada quanto a da permetrina (valores de DL50 = 0,44 e 3,70 ng/mg fêmea, respectivamente). No entanto, bioensaios combinados demonstraram sinergismo entre os óleos essenciais e a permetrina. Observou-se sinergismo significativo com a permetrina contra duas linhagens de mosquitos Aedes. Aedes aegypti foi observado no microambiente de C. rotundus e A. galanga. A adição dos óleos de C. rotundus e A. galanga reduziu significativamente os valores de DL50 da permetrina em MCM-S de 0,44 para 0,07 ng/mg e 0,11 ng/mg em fêmeas, respectivamente, com valores de razão de sinergia (RS) de 6,28 e 4,00, respectivamente. Além disso, os óleos essenciais de C. rotundus e A. galanga também reduziram significativamente os valores de DL50 da permetrina em PMD-R de 3,70 para 0,42 ng/mg e 0,003 ng/mg em fêmeas, respectivamente, com valores de RS de 8,81 e 1233,33, respectivamente.
Efeito sinérgico da combinação de óxido de etileno e permetrina no aumento da toxicidade em mosquitos adultos de duas linhagens do gênero Aedes. O Aedes aegypti demonstra um papel promissor do óxido de etileno como sinergista no aumento da eficácia antimosquito, especialmente em situações onde os compostos tradicionais são ineficazes ou inadequados.
O mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) é o principal vetor da dengue e de outras doenças virais infecciosas, como a febre amarela, a chikungunya e o vírus Zika, representando uma ameaça enorme e persistente para os seres humanos [1, 2]. O vírus da dengue é a febre hemorrágica patogênica mais grave que afeta os seres humanos, com uma estimativa de 5 a 100 milhões de casos anualmente e mais de 2,5 bilhões de pessoas em risco em todo o mundo [3]. Os surtos dessa doença infecciosa impõem um enorme fardo às populações, aos sistemas de saúde e às economias da maioria dos países tropicais [1]. De acordo com o Ministério da Saúde da Tailândia, foram relatados 142.925 casos de dengue e 141 mortes em todo o país em 2015, mais de três vezes o número de casos e mortes em 2014 [4]. Apesar das evidências históricas, a dengue foi erradicada ou drasticamente reduzida pelo mosquito Aedes. Após o controle do Aedes aegypti [5], as taxas de infecção aumentaram drasticamente e a doença se espalhou pelo mundo, em parte devido a décadas de aquecimento global. A eliminação e o controle do Ae. aedes aegypti são relativamente difíceis porque se trata de um mosquito vetor doméstico que acasala, se alimenta, repousa e deposita seus ovos dentro e ao redor de habitações humanas durante o dia. Além disso, esse mosquito tem a capacidade de se adaptar a mudanças ou perturbações ambientais causadas por eventos naturais (como secas) ou medidas de controle humano, podendo retornar aos seus níveis populacionais originais [6, 7]. Como as vacinas contra a dengue foram aprovadas apenas recentemente e não existe tratamento específico para a doença, a prevenção e a redução do risco de transmissão da dengue dependem inteiramente do controle dos mosquitos vetores e da eliminação do contato humano com esses vetores.
Em particular, o uso de produtos químicos para o controle de mosquitos desempenha um papel importante na saúde pública como componente essencial do manejo integrado de vetores. Os métodos químicos mais populares incluem o uso de inseticidas de baixa toxicidade que atuam contra larvas de mosquito (larvicidas) e mosquitos adultos (adidocidas). O controle larval por meio da redução de criadouros e o uso regular de larvicidas químicos, como organofosforados e reguladores de crescimento de insetos, é considerado importante. No entanto, os impactos ambientais adversos associados aos pesticidas sintéticos e sua manutenção complexa e trabalhosa continuam sendo uma grande preocupação [8, 9]. O controle ativo tradicional de vetores, como o controle de adultos, permanece o meio mais eficaz de controle durante surtos virais, pois pode erradicar vetores de doenças infecciosas de forma rápida e em larga escala, além de reduzir a expectativa de vida e a longevidade das populações locais de vetores [3, 10]. Quatro classes de inseticidas químicos: organoclorados (referidos apenas como DDT), organofosforados, carbamatos e piretroides, formam a base dos programas de controle de vetores, sendo os piretroides considerados a classe de maior sucesso. Eles são altamente eficazes contra diversos artrópodes e apresentam baixa toxicidade para mamíferos. Atualmente, os piretroides sintéticos constituem a maioria dos pesticidas comerciais, representando cerca de 25% do mercado global de pesticidas [11, 12]. A permetrina e a deltametrina são inseticidas piretroides de amplo espectro que têm sido usados mundialmente por décadas para controlar uma variedade de pragas de importância agrícola e médica [13, 14]. Na década de 1950, o DDT foi selecionado como o produto químico de escolha para o programa nacional de controle de mosquitos da Tailândia. Após o uso generalizado de DDT em áreas endêmicas de malária, a Tailândia gradualmente eliminou o uso de DDT entre 1995 e 2000, substituindo-o por dois piretroides: permetrina e deltametrina [15, 16]. Esses inseticidas piretroides foram introduzidos no início da década de 1990 para controlar a malária e a dengue, principalmente por meio de tratamentos com mosquiteiros e o uso de nebulização térmica e sprays de ultrabaixa toxicidade [14, 17]. No entanto, eles perderam eficácia devido à forte resistência dos mosquitos e à falta de adesão da população, devido a preocupações com a saúde pública e o impacto ambiental dos produtos químicos sintéticos. Isso representa desafios significativos para o sucesso dos programas de controle de vetores [14, 18, 19]. Para tornar a estratégia mais eficaz, são necessárias contramedidas oportunas e adequadas. Os procedimentos de manejo recomendados incluem a substituição por substâncias naturais, a rotação de produtos químicos de diferentes classes, a adição de sinergistas e a mistura de produtos químicos ou a aplicação simultânea de produtos químicos de diferentes classes [14, 20, 21]. Portanto, existe uma necessidade urgente de encontrar e desenvolver uma alternativa e sinergia ecológica, conveniente e eficaz, e este estudo visa atender a essa necessidade.
Inseticidas de origem natural, especialmente aqueles à base de componentes vegetais, têm demonstrado potencial na avaliação de alternativas atuais e futuras para o controle de mosquitos [22, 23, 24]. Diversos estudos mostraram que é possível controlar importantes vetores de mosquitos utilizando produtos vegetais, especialmente óleos essenciais (OE), como inseticidas para adultos. Propriedades adulticidas contra algumas espécies importantes de mosquitos foram encontradas em muitos óleos vegetais, como aipo, cominho, zedoária, anis, pimenta-de-chinês, tomilho, Schinus terebinthifolia, Cymbopogon citratus, Cymbopogon schoenanthus, Cymbopogon giganteus, Chenopodium ambrosioides, Cochlospermum planchonii, Eucalyptus ter eticornis, Eucalyptus citriodora, Cananga odorata e Petroselinum Criscum [25,26,27,28,29,30]. O óxido de etileno é agora utilizado não apenas isoladamente, mas também em combinação com substâncias vegetais extraídas ou pesticidas sintéticos existentes, produzindo graus variáveis de toxicidade. Combinações de inseticidas tradicionais, como organofosforados, carbamatos e piretroides, com óxido de etileno/extratos vegetais atuam de forma sinérgica ou antagônica em seus efeitos tóxicos e demonstraram ser eficazes contra vetores de doenças e pragas [31,32,33,34,35]. No entanto, a maioria dos estudos sobre os efeitos tóxicos sinérgicos de combinações de fitoquímicos com ou sem produtos químicos sintéticos foi realizada em vetores e pragas agrícolas, e não em mosquitos de importância médica. Além disso, a maior parte do trabalho sobre os efeitos sinérgicos de combinações de plantas e inseticidas sintéticos contra vetores de mosquitos tem se concentrado no efeito larvicida.
Em um estudo anterior conduzido pelos autores como parte de um projeto de pesquisa em andamento que avalia intimicidas de plantas alimentícias nativas da Tailândia, óxidos de etileno de Cyperus rotundus, galanga e canela demonstraram atividade potencial contra Aedes aegypti adulto [36]. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia de óleos essenciais isolados dessas plantas medicinais contra mosquitos Aedes aegypti, incluindo cepas resistentes e sensíveis a piretroides. O efeito sinérgico de misturas binárias de óxido de etileno e piretroides sintéticos com boa eficácia em adultos também foi analisado para reduzir o uso de inseticidas tradicionais e aumentar a resistência de mosquitos vetores, especialmente contra Aedes aegypti. Este artigo relata a caracterização química de óleos essenciais eficazes e seu potencial para aumentar a toxicidade da permetrina sintética contra mosquitos Aedes aegypti em cepas sensíveis a piretroides (MCM-S) e resistentes (PMD-R).
Os rizomas de C. rotundus e A. galanga e a casca de C. verum (Fig. 1), utilizados para a extração do óleo essencial, foram adquiridos de fornecedores de plantas medicinais na província de Chiang Mai, Tailândia. A identificação científica dessas plantas foi realizada por meio de consulta ao Sr. James Franklin Maxwell, botânico do Herbário do Departamento de Biologia da Faculdade de Ciências da Universidade de Chiang Mai (CMU), província de Chiang Mai, Tailândia, e à cientista Wannari Charoensap, do Departamento de Farmácia da Faculdade de Farmácia da Universidade Carnegie Mellon. Espécimes de referência de cada planta estão armazenados no Departamento de Parasitologia da Faculdade de Medicina da Universidade Carnegie Mellon para uso futuro.
As amostras de plantas foram secas individualmente à sombra por 3 a 5 dias em um espaço aberto com ventilação ativa e temperatura ambiente de aproximadamente 30 ± 5 °C para remover a umidade antes da extração dos óleos essenciais (OE) naturais. Um total de 250 g de cada material vegetal seco foi moído mecanicamente até se obter um pó grosso e utilizado para isolar os óleos essenciais (OE) por destilação a vapor. O aparelho de destilação consistia em uma manta de aquecimento elétrica, um balão de fundo redondo de 3000 mL, uma coluna de extração, um condensador e um dispositivo Cool Ace (Eyela Cool Ace CA-1112 CE, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Tóquio, Japão). Adicionaram-se 1600 mL de água destilada e 10 a 15 pérolas de vidro ao balão, que foi então aquecido a aproximadamente 100 °C utilizando um aquecedor elétrico por pelo menos 3 horas, até que a destilação estivesse completa e não houvesse mais produção de OE. A camada de EO foi separada da fase aquosa utilizando um funil de separação, seca com sulfato de sódio anidro (Na2SO4) e armazenada em um frasco âmbar selado a 4°C até que a composição química e a atividade dos adultos fossem examinadas.
A composição química dos óleos essenciais foi determinada simultaneamente ao bioensaio da substância adulta. A análise qualitativa foi realizada utilizando um sistema GC-MS composto por um cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard (Wilmington, CA, EUA) 7890A equipado com um detector seletivo de massa de quadrupolo simples (Agilent Technologies, Wilmington, CA, EUA) e um espectrômetro de massas MSD 5975C (EI) (Agilent Technologies).
Coluna cromatográfica – DB-5MS (30 m × DI 0,25 mm × espessura do filme 0,25 µm). O tempo total de análise por GC-MS foi de 20 minutos. As condições de análise foram: temperaturas do injetor e da linha de transferência de 250 °C e 280 °C, respectivamente; a temperatura do forno foi ajustada para aumentar de 50 °C para 250 °C a uma taxa de 10 °C/min; o gás de arraste foi o hélio; a vazão foi de 1,0 mL/min; o volume de injeção foi de 0,2 µL (1/10% v/v em CH₂Cl₂, razão de divisão 100:1). Um sistema de ionização eletrônica com energia de ionização de 70 eV foi utilizado para a detecção por GC-MS. A faixa de aquisição foi de 50 a 550 unidades de massa atômica (u.m.a.) e a velocidade de varredura foi de 2,91 varreduras por segundo. As porcentagens relativas dos componentes são expressas como porcentagens normalizadas pela área do pico. A identificação dos ingredientes dos óleos essenciais baseia-se no seu índice de retenção (IR). O IR foi calculado utilizando a equação de Van den Dool e Kratz [37] para a série dos n-alcanos (C8-C40) e comparado com índices de retenção da literatura [38] e bases de dados de bibliotecas (NIST 2008 e Wiley 8NO8). A identidade dos compostos apresentados, como a estrutura e a fórmula molecular, foi confirmada por comparação com amostras autênticas disponíveis.
Padrões analíticos para permetrina sintética e butóxido de piperonila (PBO, controle positivo em estudos de sinergia) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Kits de teste para adultos da Organização Mundial da Saúde (OMS) e doses diagnósticas de papel impregnado com permetrina (0,75%) foram adquiridos comercialmente do Centro de Controle de Vetores da OMS em Penang, Malásia. Todos os outros produtos químicos e reagentes utilizados eram de grau analítico e foram adquiridos de instituições locais na província de Chiang Mai, Tailândia.
Os mosquitos utilizados como organismos de teste no bioensaio em adultos eram mosquitos Aedes aegypti de laboratório em livre reprodução, incluindo a cepa suscetível Muang Chiang Mai (MCM-S) e a cepa resistente Pang Mai Dang (PMD-R). A cepa MCM-S foi obtida de amostras locais coletadas na área de Muang Chiang Mai, província de Chiang Mai, Tailândia, e tem sido mantida na sala de entomologia do Departamento de Parasitologia da Faculdade de Medicina da CMU desde 1995 [39]. A cepa PMD-R, que se mostrou resistente à permetrina, foi isolada de mosquitos de campo originalmente coletados em Ban Pang Mai Dang, distrito de Mae Tang, província de Chiang Mai, Tailândia, e tem sido mantida no mesmo instituto desde 1997 [40]. As cepas PMD-R foram cultivadas sob pressão seletiva para manter os níveis de resistência por meio de exposição intermitente a 0,75% de permetrina, utilizando o kit de detecção da OMS com algumas modificações [41]. Cada cepa de Ae. O mosquito Aedes aegypti foi colonizado individualmente em um laboratório livre de patógenos, a 25 ± 2 °C e 80 ± 10% de umidade relativa, com fotoperíodo de 14:10 h (claro/escuro). Aproximadamente 200 larvas foram mantidas em bandejas plásticas (33 cm de comprimento, 28 cm de largura e 9 cm de altura) preenchidas com água da torneira, na densidade de 150 a 200 larvas por bandeja, e alimentadas duas vezes ao dia com ração esterilizada para cães. Os vermes adultos foram mantidos em gaiolas úmidas e alimentados continuamente com uma solução aquosa de sacarose a 10% e uma solução de xarope multivitamínico a 10%. As fêmeas do mosquito sugam sangue regularmente para depositar seus ovos. Fêmeas com dois a cinco dias de idade, que não tenham se alimentado de sangue, podem ser utilizadas continuamente em ensaios biológicos experimentais com adultos.
Um bioensaio de resposta dose-mortalidade de óleo essencial (OE) foi realizado em fêmeas adultas de mosquitos Aedes aegypti, MCM-S e PMD-R, utilizando um método tópico modificado de acordo com o protocolo padrão da OMS para testes de suscetibilidade [42]. O OE de cada planta foi diluído serialmente com um solvente adequado (por exemplo, etanol ou acetona) para obter uma série graduada de 4 a 6 concentrações. Após anestesia com dióxido de carbono (CO2), os mosquitos foram pesados individualmente. Os mosquitos anestesiados foram então mantidos imóveis em papel de filtro seco sobre uma placa fria personalizada sob um estereomicroscópio para evitar reativação durante o procedimento. Para cada tratamento, 0,1 μl da solução de OE foi aplicado no pronoto superior da fêmea utilizando um microdispensador manual Hamilton (700 Series Microliter™, Hamilton Company, Reno, NV, EUA). Vinte e cinco fêmeas foram tratadas com cada concentração, com mortalidade variando de 10% a 95% para pelo menos 4 concentrações diferentes. Mosquitos tratados com solvente serviram como controle. Para evitar a contaminação das amostras de teste, o papel de filtro foi substituído por um novo para cada óleo essencial testado. As doses utilizadas nesses bioensaios são expressas em microgramas de óleo essencial por miligrama de peso corporal de fêmeas vivas. A atividade do PBO em adultos também foi avaliada de maneira semelhante ao óleo essencial, com o PBO sendo utilizado como controle positivo em experimentos sinérgicos. Os mosquitos tratados em todos os grupos foram colocados em copos de plástico e receberam uma solução de 10% de sacarose e 10% de xarope multivitamínico. Todos os bioensaios foram realizados a 25 ± 2 °C e 80 ± 10% de umidade relativa e repetidos quatro vezes com controles. A mortalidade durante o período de criação de 24 horas foi verificada e confirmada pela ausência de resposta do mosquito à estimulação mecânica, sendo então registrada com base na média de quatro repetições. Os tratamentos experimentais foram repetidos quatro vezes para cada amostra de teste, utilizando diferentes lotes de mosquitos. Os resultados foram resumidos e utilizados para calcular a taxa de mortalidade percentual, que foi usada para determinar a dose letal de 24 horas por meio de análise probit.
O efeito anticida sinérgico do óleo essencial (OE) e da permetrina foi avaliado utilizando um procedimento de ensaio de toxicidade local [42], conforme descrito anteriormente. Utilizou-se acetona ou etanol como solvente para preparar a permetrina na concentração desejada, bem como uma mistura binária de OE e permetrina (OE-permetrina: permetrina misturada com OE na concentração DL25). Os kits de teste (permetrina e OE-permetrina) foram avaliados contra as cepas MCM-S e PMD-R de Ae. Aedes aegypti. Cada uma das 25 fêmeas de mosquito recebeu quatro doses de permetrina para testar sua eficácia na eliminação de adultos, com cada tratamento repetido quatro vezes. Para identificar possíveis sinergistas do OE, foram administradas de 4 a 6 doses de OE-permetrina a cada uma das 25 fêmeas de mosquito, com cada aplicação repetida quatro vezes. O tratamento com PBO-permetrina (permetrina misturada com a concentração DL25 de PBO) também serviu como controle positivo. As doses utilizadas nesses bioensaios são expressas em nanogramas da amostra de teste por miligrama de peso corporal de fêmeas vivas. Quatro avaliações experimentais para cada linhagem de mosquito foram conduzidas em lotes criados individualmente, e os dados de mortalidade foram agrupados e analisados utilizando o modelo Probit para determinar a dose letal de 24 horas.
A taxa de mortalidade foi ajustada utilizando a fórmula de Abbott [43]. Os dados ajustados foram analisados por regressão Probit utilizando o programa estatístico SPSS (versão 19.0). Os valores letais de 25%, 50%, 90%, 95% e 99% (DL25, DL50, DL90, DL95 e DL99, respectivamente) foram calculados utilizando os respectivos intervalos de confiança de 95% (IC 95%). As medidas de significância e as diferenças entre as amostras testadas foram avaliadas utilizando o teste qui-quadrado ou o teste U de Mann-Whitney em cada ensaio biológico. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos para P < 0,05.< 0,05. O coeficiente de resistência (RR) é estimado no nível LD50 usando a seguinte fórmula [12]:
RR > 1 indica resistência e RR ≤ 1 indica sensibilidade. O valor da razão de sinergia (SR) de cada candidato a sinergista é calculado da seguinte forma [34, 35, 44]:
Este fator divide os resultados em três categorias: um valor de SR de 1±0,05 é considerado como não tendo efeito aparente, um valor de SR >1,05 é considerado como tendo um efeito sinérgico e um valor de SR de Um óleo líquido amarelo claro pode ser obtido por destilação a vapor dos rizomas de C. rotundus e A. galanga e da casca de C. verum. Os rendimentos calculados em peso seco foram de 0,15%, 0,27% (m/m) e 0,54% (v/v), respectivamente (Tabela 1). O estudo por GC-MS da composição química dos óleos de C. rotundus, A. galanga e C. verum mostrou a presença de 19, 17 e 21 compostos, que representaram 80,22%, 86,75% e 97,24% de todos os componentes, respectivamente (Tabela 2). O óleo do rizoma de C. lucidum é composto principalmente por ciperoneno (14,04%), seguido por carraleno (9,57%), α-capselan (7,97%) e α-capselan (7,53%). O principal componente químico do óleo do rizoma de galanga é o β-bisaboleno (18,27%), seguido por α-bergamoteno (16,28%), 1,8-cineol (10,17%) e piperonol (10,09%). Já o cinamaldeído (64,66%) foi identificado como o principal componente do óleo da casca de C. verum, enquanto o acetato cinâmico (6,61%), o α-copaeno (5,83%) e o 3-fenilpropionaldeído (4,09%) foram considerados componentes minoritários. As estruturas químicas do ciperno, do β-bisaboleno e do cinamaldeído são os principais compostos de C. rotundus, A. galanga e C. verum, respectivamente, conforme mostrado na Figura 2.
Os resultados de três óleos essenciais (OEs) avaliados contra mosquitos Aedes aegypti adultos são apresentados na Tabela 3. Todos os OEs apresentaram efeitos letais em mosquitos Aedes aegypti MCM-S em diferentes tipos e doses. O OE mais eficaz foi o de C. verum, seguido por A. galanga e C. rotundus, com valores de DL50 de 3,30, 7,97 e 10,05 μg/mg para fêmeas MCM-S, respectivamente, ligeiramente superiores a 3,22 (U = 1, Z = -0,775, P = 0,667), 7,94 (U = 2, Z = 0, P = 1) e 9,57 (U = 0, Z = -1,549, P = 0,333) μg/mg para fêmeas PMD-R. Isso corresponde ao PBO ter um efeito ligeiramente maior em adultos da cepa PMD-R do que na cepa MSM-S, com valores de DL50 de 4,79 e 6,30 μg/mg de fêmeas, respectivamente (U = 0, Z = -2,021, P = 0,057). Pode-se calcular que os valores de DL50 de C. verum, A. galanga, C. rotundus e PBO contra PMD-R são aproximadamente 0,98, 0,99, 0,95 e 0,76 vezes menores do que aqueles contra MCM-S, respectivamente. Assim, isso indica que a suscetibilidade ao PBO e ao óleo essencial é relativamente semelhante entre as duas cepas de Aedes. Embora a cepa PMD-R tenha sido mais suscetível do que a MCM-S, a sensibilidade de Aedes aegypti não foi significativa. Em contraste, as duas cepas de Aedes diferiram bastante em sua sensibilidade à permetrina (Tabela 4). A cepa PMD-R demonstrou resistência significativa à permetrina (valor de DL50 = 0,44 ng/mg em mulheres), com um valor de DL50 de 3,70 ng/mg em mulheres, comparado ao da cepa MCM-S (valor de DL50 = 0,44 ng/mg em mulheres) (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029). Embora a cepa PMD-R seja muito menos sensível à permetrina do que a MCM-S, sua sensibilidade ao PBO e aos óleos de C. verum, A. galanga e C. rotundus é ligeiramente superior à da MCM-S.
Conforme observado no bioensaio populacional com a combinação de óleo essencial (OE) e permetrina em mosquitos adultos, as misturas binárias de permetrina e OE (DL25) apresentaram sinergia (valor de SR > 1,05) ou nenhum efeito (valor de SR = 1 ± 0,05). Os efeitos complexos da mistura de OE e permetrina em mosquitos albinos experimentais, cepas MCM-S e PMD-R de Aedes aegypti, são apresentados na Tabela 4 e na Figura 3. A adição de óleo de C. verum reduziu ligeiramente a DL50 da permetrina contra a cepa MCM-S e aumentou ligeiramente a DL50 contra a cepa PMD-R para 0,44–0,42 ng/mg em mulheres e de 3,70 para 3,85 ng/mg em mulheres, respectivamente. Em contraste, a adição dos óleos de C. rotundus e A. galanga reduziu significativamente a DL50 da permetrina em MCM-S de 0,44 para 0,07 (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) e para 0,11 (U = 0, Z) = -2,309, P = 0,029) ng/mg de mulheres. Com base nos valores de DL50 de MCM-S, os valores de SR da mistura de óleo essencial e permetrina após a adição dos óleos de C. rotundus e A. galanga foram de 6,28 e 4,00, respectivamente. Consequentemente, a DL50 da permetrina contra PMD-R diminuiu significativamente de 3,70 para 0,42 (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) e para 0,003 com a adição dos óleos de C. rotundus e A. galanga (U = 0, Z = -2,337, P = 0,029) ng/mg fêmea. O valor de SR da permetrina combinada com C. rotundus contra PMD-R foi de 8,81, enquanto o valor de SR da mistura de galanga-permetrina foi de 1233,33. Em relação à cepa MCM-S, o valor de DL50 do controle positivo PBO diminuiu de 0,44 para 0,26 ng/mg (fêmeas) e de 3,70 ng/mg (fêmeas) para 0,65 ng/mg (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029) e da cepa PMD-R (U = 0, Z = -2,309, P = 0,029). Os valores de SR da mistura PBO-permetrina para as cepas MCM-S e PMD-R foram 1,69 e 5,69, respectivamente. Esses resultados indicam que os óleos de C. rotundus e A. galanga, juntamente com o PBO, aumentam a toxicidade da permetrina em maior grau do que o óleo de C. verum para as cepas MCM-S e PMD-R.
Atividade em adultos (DL50) de óleo essencial (OE), placebo (PBO), permetrina (PE) e suas combinações contra cepas de mosquitos Aedes sensíveis (MCM-S) e resistentes (PMD-R) a piretroides. Aedes aegypti
[45]. Os piretroides sintéticos são usados mundialmente para controlar quase todos os artrópodes de importância agrícola e médica. No entanto, devido às consequências nocivas do uso de inseticidas sintéticos, especialmente em termos do desenvolvimento e da disseminação da resistência dos mosquitos, bem como do impacto na saúde a longo prazo e no meio ambiente, há agora uma necessidade urgente de reduzir o uso de inseticidas sintéticos tradicionais e desenvolver alternativas [35, 46, 47]. Além de proteger o meio ambiente e a saúde humana, as vantagens dos inseticidas botânicos incluem alta seletividade, disponibilidade global e facilidade de produção e uso, tornando-os mais atraentes para o controle de mosquitos [32, 48, 49]. Este estudo, além de elucidar as características químicas de óleos essenciais eficazes por meio de análise GC-MS, também avaliou a potência de óleos essenciais de mosquitos adultos e sua capacidade de aumentar a toxicidade da permetrina sintética. aegypti em cepas sensíveis a piretroides (MCM-S) e cepas resistentes (PMD-R).
A caracterização por GC-MS mostrou que o cipereno (14,04%), o β-bisaboleno (18,27%) e o cinamaldeído (64,66%) foram os principais componentes dos óleos de C. rotundus, A. galanga e C. verum, respectivamente. Esses compostos químicos demonstraram diversas atividades biológicas. Ahn et al. [50] relataram que o 6-acetoxicipereno, isolado do rizoma de C. rotundus, atua como um composto antitumoral e pode induzir apoptose dependente de caspase em células de câncer de ovário. O β-bisaboleno, extraído do óleo essencial da árvore de mirra, exibe citotoxicidade específica contra células tumorais mamárias humanas e de camundongos, tanto in vitro quanto in vivo [51]. O cinamaldeído, obtido de extratos naturais ou sintetizado em laboratório, tem sido relatado como tendo atividades inseticidas, antibacterianas, antifúngicas, anti-inflamatórias, imunomoduladoras, anticancerígenas e antiangiogênicas [52].
Os resultados do bioensaio de atividade em adultos dependente da dose mostraram o bom potencial dos óleos essenciais testados e demonstraram que as linhagens de mosquitos Aedes MCM-S e PMD-R apresentaram suscetibilidade semelhante ao óleo essencial e ao PBO. Aedes aegypti. Uma comparação da eficácia do óleo essencial e da permetrina mostrou que esta última possui um efeito alercida mais forte: os valores de DL50 são de 0,44 e 3,70 ng/mg em fêmeas para as linhagens MCM-S e PMD-R, respectivamente. Esses achados são corroborados por diversos estudos que demonstram que pesticidas naturais, especialmente produtos derivados de plantas, são geralmente menos eficazes do que substâncias sintéticas [31, 34, 35, 53, 54]. Isso pode ocorrer porque os primeiros são uma combinação complexa de ingredientes ativos ou inativos, enquanto os últimos são um único composto ativo purificado. No entanto, a diversidade e a complexidade dos ingredientes ativos naturais com diferentes mecanismos de ação podem aumentar a atividade biológica ou dificultar o desenvolvimento de resistência em populações hospedeiras [55, 56, 57]. Muitos pesquisadores relataram o potencial antimosquito de C. verum, A. galanga e C. rotundus e seus componentes, como β-bisaboleno, cinamaldeído e 1,8-cineol [22, 36, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64]. No entanto, uma revisão da literatura revelou que não houve relatos anteriores de seu efeito sinérgico com permetrina ou outros inseticidas sintéticos contra mosquitos Aedes. Aedes aegypti.
Neste estudo, observaram-se diferenças significativas na suscetibilidade à permetrina entre as duas linhagens de Aedes aegypti. A linhagem MCM-S é sensível à permetrina, enquanto a linhagem PMD-R é muito menos sensível, com uma taxa de resistência de 8,41. Comparada à sensibilidade da linhagem MCM-S, a linhagem PMD-R é menos sensível à permetrina, mas mais sensível ao óleo essencial (OE), fornecendo uma base para estudos futuros com o objetivo de aumentar a eficácia da permetrina por meio da combinação com o OE. Um bioensaio sinérgico baseado na combinação de óleos essenciais e permetrina demonstrou que misturas binárias de OE e permetrina reduziram ou aumentaram a mortalidade de Aedes aegypti adultos. A adição de óleo de *C. verum* diminuiu ligeiramente a DL50 da permetrina contra a linhagem MCM-S, mas aumentou ligeiramente a DL50 contra a linhagem PMD-R, com valores de taxa de resistência (TR) de 1,05 e 0,96, respectivamente. Isso indica que o óleo de C. verum não apresenta efeito sinérgico ou antagônico sobre a permetrina quando testado em MCM-S e PMD-R. Em contraste, os óleos de C. rotundus e A. galanga demonstraram um efeito sinérgico significativo, reduzindo significativamente os valores de DL50 da permetrina em MCM-S ou PMD-R. Quando a permetrina foi combinada com o óleo essencial de C. rotundus e A. galanga, os valores de SR da mistura óleo essencial-permetrina para MCM-S foram 6,28 e 4,00, respectivamente. Além disso, quando a permetrina foi avaliada contra PMD-R em combinação com C. rotundus (SR = 8,81) ou A. galanga (SR = 1233,33), os valores de SR aumentaram significativamente. Vale ressaltar que tanto C. rotundus quanto A. galanga aumentaram significativamente a toxicidade da permetrina contra Ae. aegypti resistente à PMD. De forma semelhante, verificou-se que o PBO aumentou a toxicidade da permetrina, com valores de SR de 1,69 e 5,69 para as cepas MCM-S e PMD-R, respectivamente. Como C. rotundus e A. galanga apresentaram os maiores valores de SR, foram considerados os melhores sinergistas no aumento da toxicidade da permetrina em MCM-S e PMD-R, respectivamente.
Diversos estudos anteriores relataram o efeito sinérgico de combinações de inseticidas sintéticos e extratos de plantas contra várias espécies de mosquitos. Um bioensaio larvicida contra Anopheles Stephensi, realizado por Kalayanasundaram e Das [65], mostrou que o fentião, um organofosforado de amplo espectro, estava associado a Cleodendron inerme, Pedalium murax e Parthenium hysterophorus. Observou-se sinergia significativa entre os extratos, com um efeito sinérgico (ES) de 1,31, 1,38, 1,40, 1,48, 1,61 e 2,23, respectivamente. Em uma triagem larvicida de 15 espécies de mangue, o extrato de éter de petróleo de raízes aéreas de mangue foi considerado o mais eficaz contra Culex quinquefasciatus, com um valor de CL50 de 25,7 mg/L [66]. O efeito sinérgico deste extrato e do inseticida botânico piretro também foi relatado como redutor da CL50 do piretro contra larvas de C. quinquefasciatus de 0,132 mg/L para 0,107 mg/L; além disso, um fator de segurança (FS) de 1,23 foi utilizado neste estudo. [34,35,44] A eficácia combinada do extrato da raiz de Solanum citron e de vários inseticidas sintéticos (por exemplo, fentião, cipermetrina (um piretroide sintético) e timefós (um larvicida organofosforado)) contra mosquitos Anopheles foi avaliada. Stephensi [54] e C. quinquefasciatus [34]. O uso combinado de cipermetrina e extrato de éter de petróleo do fruto amarelo mostrou um efeito sinérgico sobre a cipermetrina em todas as proporções. A proporção mais eficaz foi a combinação binária 1:1, com valores de CL50 e SF de 0,0054 ppm e 6,83, respectivamente, em relação a An. Stephen West [54]. Enquanto uma mistura binária 1:1 de S. xanthocarpum e temefós foi antagônica (SF = 0,6406), a combinação S. xanthocarpum-fention (1:1) exibiu atividade sinérgica contra C. quinquefasciatus com um SF de 1,3125 [34]. Tong e Blomquist [35] estudaram os efeitos do óxido de etileno vegetal na toxicidade do carbaril (um carbamato de amplo espectro) e da permetrina para mosquitos Aedes aegypti. Os resultados mostraram que o óxido de etileno de ágar, pimenta-do-reino, zimbro, helichrysum, sândalo e gergelim aumentou a toxicidade do carbaril para mosquitos Aedes. Os valores de SR para larvas de Aedes aegypti variam de 1,0 a 7,0. Em contraste, nenhum dos óleos essenciais foi tóxico para mosquitos Aedes adultos. Até o momento, não foram relatados efeitos sinérgicos para a combinação de Aedes aegypti e óleo essencial-carbaril. O PBO foi utilizado como controle positivo para aumentar a toxicidade do carbaril contra mosquitos Aedes. Os valores de SR para larvas e adultos de Aedes aegypti são de 4,9 a 9,5 e 2,3, respectivamente. Apenas misturas binárias de permetrina e óleo essencial ou PBO foram testadas quanto à atividade larvicida. A mistura de óleo essencial-permetrina apresentou efeito antagônico, enquanto a mistura de PBO-permetrina apresentou efeito sinérgico contra larvas de Aedes aegypti. No entanto, experimentos de dose-resposta e avaliação de SR para misturas de PBO-permetrina ainda não foram realizados. Embora poucos resultados tenham sido obtidos em relação aos efeitos sinérgicos de combinações fitossintéticas contra vetores de mosquitos, estes dados corroboram os resultados existentes, o que abre a perspectiva de adicionar sinergistas não apenas para reduzir a dose aplicada, mas também para aumentar o efeito letal. Além disso, os resultados deste estudo demonstraram, pela primeira vez, que os óleos de C. rotundus e A. galanga exercem, sinergicamente, eficácia significativamente maior contra cepas de mosquitos Aedes suscetíveis e resistentes a piretroides, em comparação com o PBO, quando combinados com a toxicidade da permetrina em Aedes aegypti. Contudo, resultados inesperados da análise sinérgica mostraram que o óleo de C. verum apresentou a maior atividade antiadulto contra ambas as cepas de Aedes. Surpreendentemente, o efeito tóxico da permetrina sobre Aedes aegypti foi insatisfatório. Variações nos efeitos tóxicos e sinérgicos podem ser atribuídas, em parte, à exposição a diferentes tipos e níveis de componentes bioativos nesses óleos.
Apesar dos esforços para compreender como melhorar a eficiência, os mecanismos sinérgicos permanecem obscuros. Possíveis razões para a eficácia e o potencial sinérgico distintos podem incluir diferenças na composição química dos produtos testados e diferenças na suscetibilidade dos mosquitos associadas ao estado e desenvolvimento de resistência. Existem diferenças entre os componentes majoritários e minoritários do óxido de etileno testados neste estudo, e alguns desses compostos demonstraram ter efeitos repelentes e tóxicos contra uma variedade de pragas e vetores de doenças [61,62,64,67,68]. No entanto, os principais compostos caracterizados nos óleos de C. rotundus, A. galanga e C. verum, como o cipern, o β-bisaboleno e o cinamaldeído, não foram testados neste trabalho quanto às suas atividades anti-adultos e sinérgicas contra Aedes aegypti, respectivamente. Portanto, estudos futuros são necessários para isolar os ingredientes ativos presentes em cada óleo essencial e elucidar sua eficácia inseticida e interações sinérgicas contra esse vetor de mosquito. Em geral, a atividade inseticida depende da ação e reação entre os venenos e os tecidos dos insetos, que pode ser simplificada e dividida em três etapas: penetração na pele do corpo do inseto e nas membranas dos órgãos-alvo, ativação (= interação com o alvo) e desintoxicação das substâncias tóxicas [57, 69]. Portanto, o sinergismo entre inseticidas, resultando em maior eficácia das combinações de substâncias tóxicas, requer pelo menos uma dessas categorias, como maior penetração, maior ativação dos compostos acumulados ou menor desintoxicação do ingrediente ativo do pesticida. Por exemplo, a tolerância energética retarda a penetração na cutícula através de uma cutícula espessada e a resistência bioquímica, como o metabolismo aprimorado do inseticida observado em algumas linhagens de insetos resistentes [70, 71]. A significativa eficácia dos óleos essenciais no aumento da toxicidade da permetrina, especialmente contra PMD-R, pode indicar uma solução para o problema da resistência a inseticidas por meio da interação com os mecanismos de resistência [57, 69, 70, 71]. Tong e Blomquist [35] apoiaram os resultados deste estudo demonstrando uma interação sinérgica entre óleos essenciais e pesticidas sintéticos. Em Aedes aegypti, há evidências de atividade inibitória contra enzimas de desintoxicação, incluindo monooxigenases do citocromo P450 e carboxilesterases, que estão intimamente associadas ao desenvolvimento de resistência a pesticidas tradicionais. O PBO não só é considerado um inibidor metabólico da monooxigenase do citocromo P450, como também melhora a penetração de inseticidas, conforme demonstrado pelo seu uso como controle positivo em estudos sinérgicos [35, 72]. Curiosamente, o 1,8-cineol, um dos componentes importantes encontrados no óleo de galanga, é conhecido por seus efeitos tóxicos em espécies de insetos [22, 63, 73] e tem sido relatado como tendo efeitos sinérgicos em diversas áreas de pesquisa de atividade biológica [74, 75, 76, 77]. Além disso, o 1,8-cineol, em combinação com vários fármacos, incluindo curcumina [78], 5-fluorouracilo [79], ácido mefenâmico [80] e zidovudina [81], também apresenta efeito promotor de permeação in vitro. Assim, o possível papel do 1,8-cineol na ação inseticida sinérgica não se limita à sua função como ingrediente ativo, mas também à de intensificador de penetração. Devido ao maior sinergismo com a permetrina, especialmente contra PMD-R, os efeitos sinérgicos do óleo de galanga e do óleo de Trichosanthes observados neste estudo podem resultar de interações com mecanismos de resistência, ou seja, aumento da permeabilidade ao cloro. Os piretróides aumentam a ativação de compostos acumulados e inibem enzimas de desintoxicação, como as monooxigenases e carboxilesterases do citocromo P450. No entanto, esses aspectos requerem estudos adicionais para elucidar o papel específico do óleo essencial e de seus compostos isolados (sozinhos ou em combinação) nos mecanismos sinérgicos.
Em 1977, foram relatados níveis crescentes de resistência à permetrina em importantes populações de vetores na Tailândia e, nas décadas seguintes, o uso da permetrina foi amplamente substituído por outros piretroides, especialmente aqueles substituídos pela deltametrina [82]. No entanto, a resistência vetorial à deltametrina e a outras classes de inseticidas é extremamente comum em todo o país devido ao uso excessivo e persistente [14, 17, 83, 84, 85, 86]. Para combater esse problema, recomenda-se a rotação ou reutilização de pesticidas descartados que eram anteriormente eficazes e menos tóxicos para mamíferos, como a permetrina. Atualmente, embora o uso de permetrina tenha sido reduzido em programas recentes de controle de mosquitos do governo nacional, a resistência à permetrina ainda pode ser encontrada em populações de mosquitos. Isso pode ser devido à exposição dos mosquitos a produtos comerciais para controle de pragas domésticas, que consistem principalmente em permetrina e outros piretroides [14, 17]. Assim, o reaproveitamento bem-sucedido da permetrina requer o desenvolvimento e a implementação de estratégias para reduzir a resistência vetorial. Embora nenhum dos óleos essenciais testados individualmente neste estudo tenha sido tão eficaz quanto a permetrina, a sua utilização conjunta resultou em efeitos sinérgicos impressionantes. Este é um indício promissor de que a interação dos óleos essenciais com os mecanismos de resistência faz com que a combinação de permetrina com óleos essenciais seja mais eficaz do que o inseticida ou o óleo essencial isoladamente, particularmente contra Aedes aegypti resistente à permetrina (PMD-R). Os benefícios das misturas sinérgicas no aumento da eficácia, apesar da utilização de doses mais baixas para o controle vetorial, podem levar a uma melhor gestão da resistência e à redução de custos [33, 87]. A partir destes resultados, é gratificante notar que os óleos essenciais de A. galanga e C. rotundus foram significativamente mais eficazes do que o placebo (PBO) na sinergia da toxicidade da permetrina em ambas as estirpes sensíveis à permetrina (MCM-S) e resistentes à permetrina (PMD-R), representando uma potencial alternativa aos adjuvantes ergogênicos tradicionais.
Os óleos essenciais selecionados apresentaram efeitos sinérgicos significativos no aumento da toxicidade para adultos de Ae. aegypti resistentes à permetrina (PMD-R), especialmente o óleo de galanga, que possui um valor de SR de até 1233,33, indicando que os óleos essenciais têm grande potencial como sinergistas para aumentar a eficácia da permetrina. Isso pode estimular o uso de um novo produto natural ativo, o que, em conjunto, poderia aumentar o uso de produtos altamente eficazes para o controle de mosquitos. Revela também o potencial do óxido de etileno como um sinergista alternativo para aprimorar inseticidas mais antigos ou tradicionais, visando solucionar os problemas de resistência existentes em populações de mosquitos. O uso de plantas facilmente disponíveis em programas de controle de mosquitos não só reduz a dependência de materiais importados e caros, como também estimula esforços locais para fortalecer os sistemas de saúde pública.
Estes resultados demonstram claramente o significativo efeito sinérgico produzido pela combinação de óxido de etileno e permetrina. Os resultados destacam o potencial do óxido de etileno como sinergista vegetal no controle de mosquitos, aumentando a eficácia da permetrina contra esses insetos, especialmente em populações resistentes. Desenvolvimentos e pesquisas futuras exigirão bioanálise sinérgica dos óleos de galanga e alpinia e seus compostos isolados, combinações de inseticidas de origem natural ou sintética contra múltiplas espécies e estágios de mosquitos, e testes de toxicidade contra organismos não-alvo. O uso prático do óxido de etileno como um sinergista alternativo viável é promissor.
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Data da publicação: 08/07/2024