Os pesticidas desempenham um papel crucial no combate à escassez global de alimentos e no controle de doenças humanas transmitidas por vetores. No entanto, o crescente problema da resistência a pesticidas exige urgentemente a descoberta de novos compostos que atuem em alvos subutilizados. Os canais de potencial receptor transitório (TRPV) de insetos — Nanzhong (Nan) e inativo (Iav) — podem formar canais heterólogos (Nan-Iav) e se localizar em órgãos mecanossensoriais que medeiam o geotropismo, a audição e a propriocepção em insetos. Alguns pesticidas, como a afidopirrolidona (AP), têm como alvo o Nan-Iav por meio de mecanismos ainda desconhecidos. A AP é eficaz contra insetos sugadores (hemípteros), impedindo a alimentação ao interromper a função dos filamentos. A AP só pode se ligar ao Nan, mas apenas o Nan-Iav interage com agonistas, incluindo a nicotinamida endógena (NAM), exibindo, assim, atividade de canal. Apesar do potencial do Nan-Iav como alvo para inseticidas, pouco se sabe sobre sua montagem de canal, sítios de ligação regulatórios e regulação dependente de Ca2+, o que dificulta o desenvolvimento de novos inseticidas. Neste estudo, a microscopia crioeletrônica foi utilizada para determinar a estrutura da Nan-Iav em insetos Hemiptera no estado livre de ligantes de calmodulina, bem como com AP e NAM no limite do domínio citoplasmático de repetição de anquirina (ARD). Surpreendentemente, descobrimos que a própria proteína Nan pode formar um pentâmero, estabilizado por interações com o ARD mediadas por AP. Este estudo revela interações moleculares entre inseticidas e agonistas e a Nan-Iav, destacando a importância do ARD na função e montagem do canal e explorando o mecanismo de regulação do Ca2+.
Em um contexto de mudanças climáticas globais cada vez mais severas, a deterioração da segurança alimentar mundial é um dos maiores desafios do século XXI, com consequências em cascata para a sociedade.1,2O relatório Estado da Segurança Alimentar e Nutricional no Mundo 2023 (SOFI) da Organização Mundial da Saúde estima que aproximadamente 2,33 bilhões de pessoas em todo o mundo sofrem de insegurança alimentar moderada a grave, um problema de longa data.3,4Infelizmente, estima-se que 20% a 30% ou mais da produção agrícola seja perdida anualmente devido a pragas e patógenos, e espera-se que o aquecimento global agrave a resistência das pragas e a vulnerabilidade das culturas.4,5,6,7,8O desenvolvimento de pesticidas é crucial não apenas para proteger as plantações de pragas e reduzir a disseminação de patógenos transmitidos por vetores, mas também para combater doenças humanas transmitidas por vetores, como dengue, malária e doença de Chagas, que estão se tornando cada vez mais resistentes a pesticidas.5,9,10,11
Entre os principais alvos de inseticidas neurotóxicos, o canal heterotetramérico TRPV Nanchung (Nan)-Inativo (Iav) representa uma classe de alvos de inseticidas descoberta apenas na última década, incluindo inseticidas disponíveis comercialmente, como imidaclopride e piraclostrobina.12,13,14O inseticida semissintético afidopirrolifeno (AP) é um produto recentemente desenvolvido e comercializado, cujo principal componente é o inseticida ativo Inscalis®, que se liga ao AP em um nível de atividade subnanomolar.15O AP apresenta baixa toxicidade aguda para polinizadores, insetos benéficos e outros organismos não-alvo e, quando usado de acordo com as instruções do rótulo, pode reduzir a pressão de resistência a outros inseticidas.16,17,18Nan e Iav são amplamente distribuídos entre as espécies de insetos, são coexpressos apenas em neurônios receptores de estiramento cordal das antenas e membros, e são essenciais para a audição, percepção da gravidade e propriocepção.13,16,19,20,21,22AP, imidaclopride e piraclostrobina estimulam o complexo Nan-Iav por meio de um mecanismo único, inibindo, em última análise, a transdução do sinal proprioceptivo.13,16,23Em insetos sugadores (hemípteros), como pulgões e moscas-brancas, a perda da propriocepção prejudica sua capacidade de se alimentar, levando, em última instância, à morte.13,24Curiosamente, o AP exibe alta afinidade pelo complexo Nan-Iav e baixa afinidade por Nan isoladamente. A ligação do AP ao Nan-Iav induz uma corrente elétrica, mas a ligação a Nan isoladamente não estimula a atividade do canal. O próprio Iav não se liga ao AP.16Isso sugere que Nan e Iav podem se ligar para formar diferentes complexos de canal Nan-Iav (por exemplo, com diferentes proporções estequiométricas ou diferentes arranjos dentro da mesma proporção estequiométrica) ou que AP pode se ligar a múltiplos sítios. Além disso, o agonista natural nicotinamida (NAM) se liga ao Nan-Iav de Drosophila com afinidade micromolar, exibindo efeitos semelhantes aos dos afídeos (AP) in vitro.16,25e inibindo a reprodução e a alimentação dos pulgões, levando, em última instância, à sua morte.25,26Esses dados levantam muitas questões. Por exemplo, ainda não está claro como o heterodímero Nan-Iav é formado, quais sítios de ligação são usados para modular pequenas moléculas e como essas pequenas moléculas regulam a função do canal suprimindo a propriocepção. Além disso, permanecem obscuros os motivos pelos quais o próprio Nan é inativo e tem baixa afinidade pelo potencial de ação (PA), enquanto o heterodímero Nan-Iav é ativo e se liga ao PA com maior afinidade. Finalmente, pouco se sabe sobre a regulação da função do Nan-Iav dependente de Ca2+ e como ela se integra aos processos de sinalização neuronal.. 13,21
Neste estudo, combinando microscopia crioeletrônica, eletrofisiologia e técnicas de ligação de radioligantes, elucidamos a montagem do complexo Nan-Iav e o mecanismo de sua ligação a reguladores de pequenas moléculas. Além disso, detectamos a ligação constitutiva de calmodulina (CaM) ao Iav e a estabilização de pentâmeros de Nan por meio de ativação de proteínas (AP). Esses resultados fornecem informações importantes sobre a regulação de íons de cálcio em canais iônicos, a montagem desses canais e os fatores que determinam a afinidade de ligação de ligantes. Mais importante ainda, confirmamos que a região ARD desempenha um papel central nesses processos. Nosso estudo de canais iônicos completos de insetos ligados a pesticidas agrícolas relevantes27, 28, 29Abre perspectivas para o desenvolvimento da indústria de pesticidas, melhorando a eficácia e a especificidade dos pesticidas e permitindo a aplicação de compostos direcionados ao TRPV em outras espécies para abordar a segurança alimentar global e a disseminação de doenças transmitidas por vetores.
Descobrimos também que o Nan-Iav é regulado pelo Ca2+ e que o mecanismo de regulação é mediado pela CaM ligada constitutivamente. É importante ressaltar que essa regulação do Nav dependente de Ca2+ pela CaM difere significativamente dos mecanismos de regulação de outros canais iônicos (por exemplo, canais de Na+ dependentes de voltagem e canais TRPV5/6).52,53,54,55,56,57No canal Nav1.2, o domínio C-terminal da CaM associa-se helicoidalmente ao domínio C-terminal (CTD), e o Ca2+ induz a ligação do seu domínio N-terminal à porção distal do CTD.56No canal TRPV5/6, o domínio C-terminal da CaM se liga ao CTH, e o Ca2+ induz a extensão ascendente de seu domínio N-terminal para dentro do poro, bloqueando assim a permeabilidade a cátions.53,54Propomos um modelo para a função regulada por Ca2+ do complexo Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). Nesse modelo, o domínio N-terminal da CaM se liga constitutivamente ao domínio C-terminal (CTH) da Iav. No estado de repouso (baixa concentração de [Ca2+]), o domínio C-terminal da CaM interage com a Nan, estabilizando a conformação do domínio de ativação de Ca2+ (ARD) e, assim, promovendo a abertura do canal. A ligação de um agonista/inseticida ao canal induz a abertura do poro, levando ao influxo de Ca2+. O Ca2+ então se liga à CaM, causando a dissociação do domínio C-terminal do ARD da Nan. Como o bloqueio da ligação da CaM essencialmente elimina o efeito inibitório do Ca2+, essa dissociação modula a mobilidade do ARD, causando, assim, inibição ou dessensibilização dependente de Ca2+. A rápida recuperação das correntes do canal após a remoção dos íons de cálcio (Fig. 4g) sugere que esse mecanismo facilita respostas rápidas a sinais neuronais mediados por Ca2+. Além disso, a região C-terminal de Iav, que permanece pouco compreendida, tem sido relatada como desempenhando outras funções no direcionamento do canal e na regulação da corrente.21
Finalmente, nosso estudo apresenta a estrutura de alta resolução de um complexo de canal TRP inseticida-inseticida de importância agrícola — uma descoberta até então desconhecida. Notavelmente, caracterizamos a estrutura e a função do canal de inseto em células humanas (HEK293S GnTi–) em vez de em células de inseto. Diante da crescente resistência a inseticidas e da pressão contínua sobre a segurança alimentar e os patógenos, nosso trabalho fornece informações importantes que facilitarão o desenvolvimento de novos inseticidas para o benefício da saúde humana e da segurança alimentar global. Estudos demonstraram que inseticidas como o AP são eficazes contra algumas pragas quando usados de acordo com as instruções do rótulo e apresentam baixa toxicidade aguda para polinizadores benéficos, comprovando sua segurança ambiental.13,16Além disso, testes com alguns derivados de AP em mosquitos mostraram que eles eventualmente perdem a capacidade de voar. Compreender como esses compostos moduladores se ligam ao Nan-Iav facilitará a modificação de compostos existentes ou o desenvolvimento de novos compostos para uma ação mais eficaz.precisoControle de pragas. Nosso estudo demonstra que a interface ARD Nan-Iav é crucial não apenas para regular a atividade de compostos endógenos, pesticidas e Ca2+-CaM, mas também para a montagem do canal. Sugerimos que a interrupção da montagem do heterodímero com pequenas moléculas pode ser uma abordagem única e promissora para o desenvolvimento de inibidores de canais iônicos.
Dos oito genes ortólogos, os genes de comprimento total do besouro marrom (Halyomorpha halys) Nanchung e Inactive foram selecionados, apresentando excelente estabilidade em detergentes. Os genes sintetizados foram otimizados para expressão em humanos e clonados no vetor pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) utilizando os sítios de restrição XhoI e EcoRI. Isso garantiu que os clones estivessem em fase com as sequências C-terminais GFP-FLAG-10xHis e mCherry-FLAG-10xHis, que são clivadas pela protease HRC-3C (PPX), permitindo a expressão independente.expressãoOs primers utilizados para clonar Nanchung e Inactive no vetor pBacMam foram os seguintes:
Imagens microscópicas de partículas individuais foram obtidas em um microscópio eletrônico de transmissão Titan Krios G2 (FEI) equipado com uma câmera K3 e um filtro de energia Gatan BioQuantum. O microscópio foi operado a 300 keV, com uma configuração de energia de 20 eV, um tamanho de pixel da amostra de 1,08 Å/pixel (ampliação nominal de 81.000x) e um gradiente de desfocagem variando de -0,8 a -2,2 μm. A gravação de vídeo foi realizada a 40 quadros por segundo usando um microscópio Latitude S (Gatan) com uma taxa de dose nominal de 25 e–px−1 s−1, um tempo de exposição de 2,4 s e uma dose total de aproximadamente 60 e–Å−2.
A correção do movimento induzido pelo feixe e a ponderação da dose foram realizadas no filme usando o MotionCor2 no RELION 4.061. A estimativa dos parâmetros da função de transferência de contraste (CTF) foi realizada no cryoSPARC usando o método de estimativa de CTF baseado em patches62. Fotomicrografias com resolução de ajuste de CTF ≥4 Å foram excluídas das análises subsequentes. Tipicamente, um subconjunto de 500 a 1000 fotomicrografias foi usado para a seleção de pontos no cryoSPARC, seguido por várias rodadas de classificação 2D após a filtragem para obter uma imagem de referência clara para a seleção de partículas baseada em modelo. As partículas foram então extraídas usando caixas delimitadoras de 64 pixels e agrupamento em 4 níveis. Várias rodadas de classificação 2D foram realizadas para remover categorias de partículas indesejadas. O modelo 3D inicial foi reconstruído usando reconstrução ab initio e refinado usando refinamento não uniforme no cryoSPARC. A classificação 3D foi realizada no cryoSPARC ou no RELION com base na heterogeneidade da ARD. Nenhuma heterogeneidade significativa dos domínios da membrana foi observada. As partículas foram refinadas usando os métodos C1 e C2; partículas com resolução C2 mais alta foram consideradas simétricas em relação a C2 e importadas para o RELION para refinamento Bayesiano. As partículas foram então transferidas de volta para o cryoSPARC para refinamento final não uniforme e local. A resolução final e a contagem de partículas são mostradas na Tabela 1.
Ao processar pentâmeros de Nan+AP, exploramos vários métodos para melhorar a resolução dos domínios da membrana (especialmente a região do poro), como subtração de sinal e mascaramento do TMD. No entanto, essas tentativas não foram bem-sucedidas devido à desordem potencialmente extrema na região do poro e à heterogeneidade geral do TMD. A resolução final foi calculada usando uma máscara gerada automaticamente pelo método de processamento não uniforme no cryoSPARC, visando principalmente a região ARD. Isso resultou em uma resolução significativamente maior do que a dos domínios da membrana (especialmente a região VSLD).
Os modelos iniciais de novo das formas apo dos fármacos Nanchung e Inativo foram gerados usando o Coot63, e os modelos dos fármacos Nan e Iav foram gerados usando o AlphaFold264 para identificar regiões de baixa confiança. A modelagem da calmodulina foi baseada em ajustes de corpo rígido dos modelos com e sem Ca2+ presentes nos acessos PDB 4JPZ56 e 1CFD65, respectivamente. Os modelos foram refinados usando refinamento esférico para garantir a estereoquímica correta e uma boa geometria. A fosfatidilcolina, a fosfatidiletanolamina e a fosfatidilserina foram então modeladas como densidades lipídicas bem definidas, e os ligantes NAM e AP foram posicionados nas densidades correspondentes nas junções estreitas. Os arquivos de restrição foram gerados a partir da string SMILES das isoformas usando o eLBOW no PHENIX66. Finalmente, os modelos foram refinados no espaço real no PHENIX usando busca em grade local e minimização global com restrições de estrutura secundária. O servidor MolProbity foi usado para refinamento do modelo e análise estrutural, e as ilustrações foram realizadas usando PyMOL e UCSF Chimera X. 67,68,69 A análise de abertura foi realizada usando o servidor HOLE,70 e o mapeamento de conservação de sequência foi realizado usando o servidor Consurf.71
A análise estatística foi realizada utilizando Igor Pro 6.2, Excel Office 365 e GraphPad Prism 7.0. Todos os dados quantitativos são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). O teste t de Student (bicaudal, não pareado) foi utilizado para comparar dois grupos. A análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida pelo teste post hoc de Dunnett, foi utilizada para comparar múltiplos grupos. *P < 0,05< 0,05, **P< 0,01 e ***PValores de p < 0,001 foram considerados estatisticamente significativos, dependendo da distribuição dos dados. Os valores de Kd e Ki, bem como seus intervalos de confiança assimétricos de 95%, foram calculados utilizando o GraphPad Prism 10.
Para obter mais detalhes sobre a metodologia do estudo, consulte o Resumo do Relatório do Portfólio da Natureza, cujo link está neste artigo.
O modelo inicial foi construído utilizando os modelos de calmodulina dos bancos de dados PDB 4JPZ e 1CFD. As coordenadas foram depositadas no Protein Data Bank (PDB) sob os números de acesso 9NVN (Nan-Iav-CaM sem ligante), 9NVO (Nan-Iav-CaM ligado à nicotinamida), 9NVP (Nan-Iav-CaM ligado à nicotinamida e EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM ligado à afenidolpirrolina e cálcio), 9NVR (Nan-Iav-CaM ligado à afenidolpirrolina e EDTA) e 9NVS (pentâmero de Nan ligado à afenidolpirrolina). As imagens correspondentes de microscopia crioeletrônica foram depositadas no Banco de Dados de Microscopia Eletrônica (EMDB) sob os seguintes números de acesso: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM sem ligante), EMD-49845 (complexo Nan-Iav-CaM com nicotinamida), EMD-49846 (complexo Nan-Iav-CaM com nicotinamida e EDTA), EMD-49847 (complexo Nan-Iav-CaM com afidopirrolina e cálcio), EMD-49848 (complexo Nan-Iav-CaM com afidopirrolina e EDTA) e EMD-49849 (complexo pentamérico de Nan com afidopirrolina). Os dados brutos para a análise funcional são apresentados neste artigo.
Data da publicação: 28/01/2026