Materiais vegetais e patogênicos
Uma população de mapeamento de associação de sorgo, conhecida como população de conversão de sorgo (SCP), foi fornecida pelo Dr. Pat Brown, da Universidade de Illinois (atualmente na UC Davis). Ela já foi descrita anteriormente e consiste em uma coleção de diversas linhagens convertidas para insensibilidade ao fotoperíodo e menor estatura, a fim de facilitar o crescimento e o desenvolvimento das plantas em ambientes dos EUA. 510 linhagens dessa população foram utilizadas neste estudo, embora, devido à má germinação e outros problemas de controle de qualidade, nem todas as linhagens tenham sido utilizadas na análise das três características. Dados de 345 linhagens foram utilizados para a análise da resposta à quitina, 472 linhagens para a resposta à flg22 e 456 para a resistência à TLS.B. cookeiA cepa LSLP18 foi obtida do Dr. Burt Bluhm da Universidade de Arkansas.
Medição da resposta MAMP
Neste estudo, foram utilizados dois MAMPs diferentes: flg22 (catálogo Genscript nº RP19986) e quitina. As plantas de sorgo foram cultivadas em substratos dispostos em bandejas preenchidas com solo (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) em estufa. As plantas foram irrigadas no dia anterior à coleta das amostras para evitar umidade excessiva das folhas no dia da coleta.
As linhagens foram randomizadas e, por razões logísticas, plantadas em lotes de 60 linhagens. Para cada linhagem, três "vasos" foram plantados com duas sementes por linhagem. Os lotes subsequentes foram plantados assim que o lote anterior foi processado, até que toda a população fosse avaliada. Dois ensaios experimentais foram conduzidos para ambos os MAMPs, com os genótipos re-randomizados em cada um dos dois ensaios.
Os ensaios de ROS foram realizados conforme descrito anteriormente. Resumidamente, para cada linha, seis sementes foram plantadas em 3 vasos diferentes. Das mudas resultantes, três foram selecionadas com base na uniformidade. Mudas que pareciam incomuns ou eram significativamente mais altas ou mais baixas do que a maioria não foram utilizadas. Quatro discos foliares de 3 mm de diâmetro foram excisados da parte mais larga da 4ª folha de três diferentes plantas de sorgo com 15 dias de idade. Um disco por folha de duas plantas e dois discos de uma planta, com o segundo disco se tornando o controle de água (veja abaixo). Os discos foram flutuados individualmente em 50 µl de H20 em uma placa preta de 96 poços, selada com um selo de alumínio para evitar a exposição à luz e mantida em temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, uma solução de reação foi preparada utilizando 2 mg/ml de sonda quimioluminescente L-012 (Wako, catálogo nº 120-04891), 2 mg/ml de peroxidase de raiz-forte (Tipo VI-A, Sigma-Aldrich, catálogo nº P6782) e 100 mg/ml de quitina ou 2 μM de Flg22. 50 µl dessa solução de reação foram adicionados a três dos quatro poços. O quarto poço foi um controle simulado, ao qual foi adicionada a solução de reação, excluindo o MAMP. Quatro poços em branco contendo apenas água também foram incluídos em cada placa.
Após a adição da solução reacional, a luminescência foi medida utilizando o leitor de microplacas multidetecção SynergyTM 2 (BioTek) a cada 2 minutos durante 1 hora. O leitor de placas realizou medições de luminescência a cada 2 minutos durante essa 1 hora. A soma de todas as 31 leituras foi calculada para fornecer o valor para cada poço. O valor estimado para a resposta de MAMP para cada genótipo foi calculado como (valor médio de luminescência dos três poços experimentais — o valor do poço simulado) menos o valor médio do poço em branco. Os valores dos poços em branco foram consistentemente próximos de zero.
Discos de folhas deNicotiana benthamiana, uma linha de sorgo de alta resposta (SC0003) e uma linha de sorgo de baixa resposta (PI 6069) também foram incluídas como controles em cada placa de 96 poços para fins de controle de qualidade.
B. cookeipreparação e inoculação do inóculo
B. cookeiO inóculo foi preparado conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os grãos de sorgo foram embebidos em água por três dias, enxaguados, transferidos para frascos cônicos de 1L e autoclavados por uma hora a 15 psi e 121 °C. Os grãos foram então inoculados com cerca de 5 ml de micélio macerado de uma cultura fresca deB. cookeiOs isolados de LSLP18 foram mantidos em temperatura ambiente por 2 semanas, agitando os frascos a cada 3 dias. Após 2 semanas, os grãos de sorgo infestados pelo fungo foram secos ao ar e armazenados a 4 °C até a inoculação em campo. O mesmo inóculo foi utilizado durante todo o ensaio e renovado anualmente. Para a inoculação, 6 a 10 grãos infestados foram colocados no verticilo de plantas de sorgo com 4 a 5 semanas de idade. Os esporos produzidos por esses fungos iniciaram a infecção nas plantas jovens de sorgo em uma semana.
Preparação de sementes
Antes do plantio no campo, as sementes de sorgo foram tratadas com uma mistura de fungicida, inseticida e protetor de sementes contendo ~ 1% do fungicida Spirato 480 FS, 4% do fungicida Sebring 480 FS e 3% do protetor de sementes Sorpro 940 ES. Em seguida, as sementes foram secas ao ar por 3 dias, o que proporcionou uma fina camada dessa mistura ao redor das sementes. O protetor de sementes permitiu o uso do herbicida Dual Magnum como tratamento de pré-emergência.
Avaliação da resistência à mancha foliar alvo
O SCP foi plantado na Central Crops Research Station em Clayton, NC em 14-15 de junho de 2017 e 20 de junho de 2018 em um delineamento de blocos casualizados completos com duas repetições experimentais em cada caso. Os experimentos foram plantados em fileiras simples de 1,8 m com uma largura de fileira de 0,9 m usando 10 sementes por parcela. Duas fileiras de borda foram plantadas ao redor da periferia de cada experimento para evitar efeitos de borda. Os experimentos foram inoculados em 20 de julho de 2017 e 20 de julho de 2018, ponto em que as plantas de sorgo estavam no estágio de crescimento 3. As classificações foram feitas em uma escala de um a nove, onde as plantas que não mostraram sinais de doença foram pontuadas como nove e as plantas completamente mortas foram pontuadas como um. Duas classificações foram feitas em 2017 e quatro leituras em 2018 começando duas semanas após a inoculação a cada ano. sAUDPC (área padronizada sob a curva de progressão da doença) foi calculada conforme descrito anteriormente.
Horário da publicação: 01/04/2021