Materiais sobre plantas e patógenos
Uma população de mapeamento de associação de sorgo, conhecida como população de conversão de sorgo (SCP, na sigla em inglês), foi fornecida pelo Dr. Pat Brown da Universidade de Illinois (atualmente na UC Davis). Ela já foi descrita anteriormente e consiste em uma coleção de diversas linhagens convertidas para insensibilidade ao fotoperíodo e porte menor, visando facilitar o crescimento e o desenvolvimento das plantas em ambientes dos EUA. Quinhentas e dez linhagens dessa população foram utilizadas neste estudo, embora, devido à baixa germinação e outros problemas de controle de qualidade, nem todas as linhagens tenham sido utilizadas na análise das três características. Ao final, dados de 345 linhagens foram utilizados para a análise da resposta à quitina, 472 linhagens para a resposta ao gene flg22 e 456 para a resistência à síndrome da mancha foliar tropical (TLS).B. cookeiA cepa LSLP18 foi obtida com o Dr. Burt Bluhm da Universidade do Arkansas.
Medição da resposta MAMP
Neste estudo, foram utilizados dois MAMPs diferentes: flg22 (Genscript, catálogo nº RP19986) e quitina. As plantas de sorgo foram cultivadas em recipientes colocados em bandejas preenchidas com solo (33% de substrato Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) em estufa. As plantas foram regadas no dia anterior à coleta das amostras para evitar o excesso de umidade nas folhas no dia da coleta.
As linhagens foram aleatorizadas e, por razões logísticas, plantadas em lotes de 60 linhagens. Para cada linhagem, três vasos foram plantados com duas sementes por linhagem. Os lotes subsequentes foram plantados assim que o lote anterior fosse processado, até que toda a população fosse avaliada. Dois experimentos foram conduzidos para ambos os MAMPs, com os genótipos sendo realeatorizados em cada um dos experimentos.
Os ensaios de ROS foram realizados conforme descrito anteriormente. Resumidamente, para cada linhagem, seis sementes foram plantadas em 3 vasos diferentes. Das plântulas resultantes, três foram selecionadas com base na uniformidade. Plântulas com aparência incomum ou significativamente mais altas ou mais baixas que a maioria foram descartadas. Quatro discos foliares de 3 mm de diâmetro foram excisados da parte mais larga da 4ª folha de três plantas de sorgo diferentes com 15 dias de idade. Um disco por folha de duas plantas e dois discos de uma planta, sendo o segundo disco utilizado como controle com água (ver abaixo). Os discos foram individualmente colocados em 50 µl de H2O em uma placa de 96 poços preta, selada com uma tampa de alumínio para evitar a exposição à luz e mantida à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, preparou-se uma solução de reação utilizando 2 mg/ml da sonda quimioluminescente L-012 (Wako, catálogo nº 120-04891), 2 mg/ml de peroxidase de rábano (Tipo VI-A, Sigma-Aldrich, catálogo nº P6782) e 100 mg/ml de quitina ou 2 μM de Flg22. Adicionou-se 50 µl dessa solução de reação a três dos quatro poços. O quarto poço serviu como controle negativo, ao qual foi adicionada a solução de reação sem o MAMP. Quatro poços em branco contendo apenas água também foram incluídos em cada placa.
Após a adição da solução de reação, a luminescência foi medida usando o leitor de microplacas de detecção múltipla Synergy™ 2 (BioTek) a cada 2 minutos durante 1 hora. O leitor de placas realizou medições de luminescência a cada 2 minutos durante esse período. A soma de todas as 31 leituras foi calculada para obter o valor de cada poço. O valor estimado da resposta MAMP para cada genótipo foi calculado como (valor médio de luminescência dos três poços experimentais – valor do poço controle) – menos o valor médio do poço em branco. Os valores do poço em branco foram consistentemente próximos de zero.
Discos foliares deNicotiana benthamianaUma linhagem de sorgo altamente responsiva (SC0003) e uma linhagem de sorgo pouco responsiva (PI 6069) também foram incluídas como controles em cada placa de 96 poços para fins de controle de qualidade.
B. cookeipreparação do inóculo e inoculação
B. cookeiO inóculo foi preparado conforme descrito anteriormente. Resumidamente, os grãos de sorgo foram imersos em água por três dias, enxaguados, colocados em frascos cônicos de 1 L e autoclavados por uma hora a 15 psi e 121 °C. Os grãos foram então inoculados com cerca de 5 ml de micélio macerado de uma cultura fresca deB. cookeiOs isolados de LSLP18 foram mantidos por 2 semanas à temperatura ambiente, com agitação dos frascos a cada 3 dias. Após 2 semanas, os grãos de sorgo infestados pelo fungo foram secos ao ar e armazenados a 4 °C até a inoculação em campo. O mesmo inóculo foi utilizado durante todo o experimento e preparado anualmente. Para a inoculação, 6 a 10 grãos infestados foram colocados no cartucho de plantas de sorgo com 4 a 5 semanas de idade. Os esporos produzidos por esses fungos iniciaram a infecção nas plantas jovens de sorgo em uma semana.
Preparação das sementes
Antes do plantio no campo, as sementes de sorgo foram tratadas com uma mistura de fungicida, inseticida e protetor de sementes contendo aproximadamente 1% de fungicida Spirato 480 FS, 4% de fungicida Sebring 480 FS e 3% de protetor de sementes Sorpro 940 ES. Em seguida, as sementes foram secas ao ar por 3 dias, o que proporcionou uma fina camada dessa mistura ao redor delas. O protetor permitiu o uso do herbicida Dual Magnum como tratamento pré-emergente.
Avaliação da resistência à mancha foliar alvo
O experimento SCP foi realizado na Estação Central de Pesquisa de Culturas em Clayton, Carolina do Norte, nos dias 14 e 15 de junho de 2017 e 20 de junho de 2018, em um delineamento experimental de blocos casualizados completos com duas repetições em cada caso. Os experimentos foram semeados em fileiras simples de 1,8 m de comprimento e 0,9 m de largura, utilizando 10 sementes por parcela. Duas fileiras de bordadura foram plantadas ao redor da periferia de cada experimento para evitar efeitos de borda. Os experimentos foram inoculados em 20 de julho de 2017 e 20 de julho de 2018, quando as plantas de sorgo estavam no estádio de crescimento 3. As avaliações foram feitas em uma escala de um a nove, onde plantas sem sinais de doença receberam pontuação nove e plantas completamente mortas receberam pontuação um. Duas avaliações foram realizadas em 2017 e quatro em 2018, começando duas semanas após a inoculação em cada ano. A sAUDPC (área padronizada sob a curva de progressão da doença) foi calculada conforme descrito anteriormente.
Data da publicação: 01/04/2021