Materiais vegetais e patógenos
Uma população de mapeamento de associação de sorgo conhecida como população de conversão de sorgo (SCP) foi fornecida pelo Dr. Pat Brown da Universidade de Illinois (agora na UC Davis).Foi descrito anteriormente e é uma coleção de diversas linhagens convertidas em insensibilidade ao fotoperíodo e menor estatura para facilitar o crescimento e desenvolvimento das plantas em ambientes dos EUA.510 linhagens desta população foram utilizadas neste estudo, embora devido à má germinação e outros problemas de controle de qualidade, nem todas as linhagens tenham sido utilizadas na análise de todas as três características.Em última análise, foram utilizados dados de 345 linhas para a análise da resposta à quitina, 472 linhas para a resposta flg22 e 456 para a resistência ao TLS.B. Cookeia cepa LSLP18 foi obtida do Dr. Burt Bluhm da Universidade de Arkansas.
Medição de resposta MAMP
Dois MAMPs diferentes foram utilizados neste estudo flg22, (catálogo Genscript# RP19986) e quitina.As plantas de sorgo foram cultivadas em inserções colocadas em planos cheios de solo (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) na estufa.As plantas foram regadas um dia antes da coleta das amostras para evitar umidade extra nas folhas no dia da coleta.
As linhas foram randomizadas e, por questões logísticas, foram plantadas em lotes de 60 linhas.Para cada linha foram plantados três ‘vasos’ com duas sementes por linha.Os lotes subsequentes foram plantados assim que o lote anterior foi processado, até que toda a população fosse avaliada.Duas execuções experimentais foram conduzidas para ambos os MAMPs com genótipos re-randomizados em cada uma das duas execuções.
Os ensaios de ROS foram realizados conforme descrito anteriormente.Resumidamente, para cada linha foram plantadas seis sementes em 3 vasos diferentes.Das mudas resultantes, três foram selecionadas com base na uniformidade.Mudas que pareciam incomuns ou eram significativamente mais altas ou mais baixas que a maioria não foram utilizadas.Quatro discos foliares de 3 mm de diâmetro foram excisados da parte mais larga da 4ª folha de três diferentes plantas de sorgo com 15 dias de idade.Um disco por folha de duas plantas e dois discos de uma planta, sendo o segundo disco o controle de água (veja abaixo).Os discos foram flutuados individualmente em 50 µl de H2O em uma placa preta de 96 poços, selada com selo de alumínio para evitar exposição à luz e mantidos em temperatura ambiente durante a noite.Na manhã seguinte, uma solução de reação foi preparada usando sonda quimioluminescente L-012 a 2 mg/ml (Wako, número de catálogo 120-04891), peroxidase de rábano 2 mg/ml (Tipo VI-A, Sigma-Aldrich, número de catálogo P6782) e 100 mg/ml de quitina ou 2 μM de Flg22.50 µl desta solução reaccional foram adicionados a três dos quatro poços.O quarto poço foi um controlo simulado, ao qual foi adicionada a solução reaccional excluindo o MAMP.Quatro poços em branco contendo apenas água também foram incluídos em cada placa.
Após a adição da solução reaccional, a luminescência foi medida utilizando o leitor de microplacas de detecção múltipla SynergyTM 2 (BioTek) a cada 2 minutos durante 1 hora.O leitor de placas faz medições de luminescência a cada 2 minutos durante esta 1 h.A soma de todas as 31 leituras foi calculada para fornecer o valor de cada poço.O valor estimado para a resposta MAMP para cada genótipo foi calculado como (valor médio de luminescência dos três poços experimentais - o valor do poço simulado) menos o valor médio do poço em branco.Os valores do poço em branco foram consistentemente próximos de zero.
Discos de folhas deNicotiana benthamiana, uma linhagem de sorgo de alta resposta (SC0003) e uma linhagem de sorgo de baixa resposta (PI 6069) também foram incluídas como controles em cada placa de 96 poços para fins de controle de qualidade.
B. Cookeipreparação e inoculação do inóculo
B. Cookeio inóculo foi preparado conforme descrito anteriormente.Resumidamente, os grãos de sorgo foram embebidos em água durante três dias, enxaguados, colocados em frascos cônicos de 1L e autoclavados por uma hora a 15psi e 121°C.Os grãos foram então inoculados com cerca de 5 ml de micélio macerado de uma cultura fresca deB. CookeiIsolados de LSLP18 e deixados por 2 semanas em temperatura ambiente, agitando os frascos a cada 3 dias.Após 2 semanas, os grãos de sorgo infestados com fungo foram secos ao ar e depois armazenados a 4 °C até a inoculação no campo.O mesmo inóculo foi usado durante todo o ensaio e preparado todos os anos.Para a inoculação, 6 a 10 grãos infestados foram colocados no verticilo de plantas de sorgo com 4 a 5 semanas de idade.Os esporos produzidos por esses fungos iniciaram a infecção nas plantas jovens de sorgo em uma semana.
Preparação de sementes
Antes do plantio no campo, a semente de sorgo foi tratada com uma mistura de fungicida, inseticida e protetor contendo ~ 1% de fungicida Spirato 480 FS, 4% de fungicida Sebring 480 FS, 3% de protetor de sementes Sorpro 940 ES.Em seguida, as sementes foram secas ao ar durante 3 dias, o que proporcionou uma fina camada desta mistura ao redor das sementes.O fitoprotetor permitiu o uso do herbicida Dual Magnum como tratamento pré-emergente.
Avaliação da resistência à mancha foliar alvo
O SCP foi plantado na Central Crops Research Station em Clayton, NC, de 14 a 15 de junho de 2017 e 20 de junho de 2018, em um desenho de blocos completos aleatórios com duas repetições experimentais em cada caso.Os experimentos foram plantados em fileiras simples de 1,8 m com largura de fileira de 0,9 m, utilizando 10 sementes por parcela.Duas linhas de borda foram plantadas ao redor da periferia de cada experimento para evitar efeitos de borda.Os experimentos foram inoculados em 20 de julho de 2017 e 20 de julho de 2018, momento em que as plantas de sorgo estavam no estágio de crescimento 3. As classificações foram feitas em escalas de um a nove, onde as plantas que não apresentavam sinais de doença foram pontuadas como nove e completamente plantas mortas foram pontuadas como um.Duas avaliações foram realizadas em 2017 e quatro leituras em 2018, começando duas semanas após a inoculação de cada ano.sAACPD (área padronizada sob a curva de progressão da doença) foi calculada conforme descrito anteriormente.
Horário da postagem: 01/04/2021